高糖培养人肾小球系膜细胞对TGF-β1、FN、Smad7表达的影响

洪 练 李 竞 高 凌 陈红敏

高糖培养人肾小球系膜细胞对TGF-β1、FN、Smad7表达的影响

洪 练 李 竞 高 凌 陈红敏

本文2010—12—14收到，2011—03—02修回，2010—03—04接受

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症，是导致终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要原因［1］，虽然糖尿病患者的高血糖、高血脂、高血压有很多好的治疗控制方法，但DN的发病率仍然居高不下。因此，研究DN的发生机制和治疗方案是临床亟待解决的问题。Smad蛋白是目前唯一所知的转化生长因子—β1（TGF-β1）的 胞 内 信 号 转 导 因 子［2］，Smad7 是TGF-β1／Smad信号转导途径的负反馈调节因子，在DN的发病过程中，Smad7的表达失衡可能是致病环节之一。本文通过体外实验，观察高糖状态下TGF-β1、纤维连接蛋白（FN）增多的同时，Smad7表达的变化，探讨Smad7在细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）沉积中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

FN、TGF-β1 ELISA试剂盒购自中国博士德公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒由立陶宛Fer-mentas公司提供；Smad7多克隆抗体、β-actin兔抗人多克隆抗体由美国Santa Cruz公司出品；辣根过氧化物酶（HRP）标记抗羊抗兔二抗，NC膜、RIPA裂解液、PMSF、凝胶试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、封闭液、一抗二抗稀释液、ECL Plus化学发光试剂盒均为碧云天公司产品；TGF-β1、FN、GAPDH 引物由上海生工合成；T Personal型PCR仪由德国Biometra公司生产；Gel Doc2000凝胶成像扫描分析系统由美国Biorad公司出品。

1.2 细胞培养和分组

人肾小球系膜细胞（HMCs）购自中南大学湘雅医学院，以含15%的胎牛血清及含青霉素和链霉素（100μg／L）的DMEM 低糖（5.6mmol／L）培养基，置37℃孵箱（5%CO2）培养，2～3天换液1次。按0.3×106／孔密度将上述细胞均匀接种于6孔培养板中，80%融合后换无血清DMEM低糖培养基继续培养24h以同步化细胞，作为低糖培养对照组；随后换30mmol／L高糖培养基继续培养24h、48h、72h，分别为高糖培养24h组、48h组和72h组，后分别收集上清液并提取蛋白、RNA；—70℃保存备用。

1.3 RT-PCR检测 TGF—β1、FN、Smad7mRNA表达

Trizol试剂盒一步法提取各组细胞总RNA，取2μg，用逆转录试剂盒合成cDNA，取1μl逆转录产物，应用特异性 TGF-β1、FN、Smad7及 GAPDH 引物行PCR扩增。TGF-β1引物：上游引物5’-GGT GGA AAC CCA CAA CGA A-3’，下游引物5’-CTA AGG CGA AAG CCC TCA AT-3’，终产物为321bp。Smad7引物：上游引物5’-AGC AGG CCA CAC ACT TCA AACT -3’，下游引物 5’-CAC GTT GTC TCC CCA TCT G-3’，终产物为375bp。FN引物：上游引物5’-TAG CCC TGT CCA GGA GTT CA-3’，下游引物5’-CTG CAA GCC TTC AAT AGT CA -3’，终产物为346bp。GAPDH引物：上游引物5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，终产物为452bp。TGF-β1反应条件：94℃预变性5 min，然后94℃30s、58℃30s、72℃50s循环35次，最后72℃延伸10 min；Smad7反应条件：94℃预变性5 min，然后94℃40 s、56℃30s、72℃50s循环35次，最后72℃延伸10 min；FN反应条件：94℃预变性5 min，然后94℃30s、60℃30s、72℃50s循环40次，最后72℃延伸10 min。PCR产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶电泳图像扫描分析系统进行分析，以目的基因片段与GAPDH片段的条带灰度比值表示相对含量。

1.4 ELISA检测 TGF—β1、FN蛋白表达

收集培养不同时间的HMCs上清液，依照试剂盒说明的方法测定其TGF—β1、FN浓度。每份标本均设3个复孔，以其均值代表实验数值。

1.5 Western blotting检测Smad7蛋白表达

用BCA蛋白质分析试剂盒测定总蛋白浓度。取总蛋白75μg经12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜，用丽春红染色观察转移效果并标示相对分子量标准。然后用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h。洗膜后加入Smad7抗体（1∶800稀释），4℃过夜。再用辣根过氧化酶标记的羊抗兔多抗（1∶5000稀释）杂交1h；洗膜后加ECL（增强化学发光），最后将硝酸纤维膜放入X线片暗盒，压片、显影、定影。用分析系统软件对条带进行定量分析，测定杂交条带的吸光度。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 高糖培养 HMCs不同时间对 TGF-β1、FN、Smad7 m RNA表达的影响

本试验中所提取RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，28S、18S、5S清晰可见，A260／A280在1.8～2.0，提示所提RNA结构完整，纯度较高。各组TGF-β1、FN mRNA表达结果见表1、图1和图2。统计学分析表明，高糖培养各组TGF—β1、FN mRNA表达均较低糖对照组显著升高（P＜0.01）；TGF-β1 mRNA表达在培养48h达到高峰；FN mRNA表达随着高糖培养时间的延长而逐渐升高。Smad7 mR-NA表达结果见表1和图3。随着高糖培养时间的延长，Smad7 mRNA表达较低糖对照组下降，从48h开始两者差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 高糖培养HMCs不同时间后TGF—β1、FN、Smad7 mRNA的表达结果（灰度比值，±s，n均＝3）

表1 高糖培养HMCs不同时间后TGF—β1、FN、Smad7 mRNA的表达结果（灰度比值，±s，n均＝3）

注：与低糖对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

组 别 TGF-β1 0.37±0.01 0.40±0.06 0.78±0.12培养24h组 0.64±0.022） 0.78±0.172） 0.64±0.10培养48h组 0.67±0.012） 0.82±0.142） 0.60±0.141）培养72h组 0.64±0.012） 0.91±0.172） 0.59±0.131）FN Smad7低糖对照组

图1 高糖培养HMCs不同时间对TGF—β1 mRNA表达的影响

图2 高糖培养HMCs不同时间对FN mRNA表达的影响

图3 高糖培养HMCs不同时间对Smad7 mRNA表达的影响

2.2 高糖培养 HMCs不同时间对TGF—β1、FN蛋白浓度的影响

与低糖对照组相比，高糖各组TGF-β1、FN蛋白浓度均明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；TGF-β1在48h到达高峰，FN浓度随培养时间延长而升高。见表2。

表2 高糖培养HMCs不同时间后TGF—β1和FN蛋白浓度变化（±s，n均＝3）

表2 高糖培养HMCs不同时间后TGF—β1和FN蛋白浓度变化（±s，n均＝3）

注：与低糖对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01

组 别 TGF-β1（pg／ml） FN（ng／ml）低糖对照组274.48±10.28 44.13±2.29培养24h组 316.07±27.202） 95.57±10.912）培养48h组 324.40±16.892） 166.74±16.342）培养72h组 314.23±19.771） 236.94±13.202）

2.3 高糖培养HMCs不同时间对Smad7蛋白表达的影响

与低糖对照组比较，高糖培养各组Smad7蛋白表达均下降，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）见图4。

图4 高糖培养HMCs不同时间对Smad7蛋白表达的影响

3 讨 论

DN是糖尿病微血管并发症之一，也是尿毒症的主要病因之一。肾小球ECM累积所致的肾小球硬化对DN患者肾功能衰竭的进展有着非常重要的意义。FN是ECM的主要组成成分，在正常肾组织中主要分布于肾小球系膜区，对维持肾小球正常结构起重要作用。Van Det等［3］研究发现葡萄糖浓度升高可刺激HMCs的FN m RNA表达及FN蛋白合成，这种作用通过TGF介导，在很大程度上依赖于内源性 TGF—β1活性的增高，而抗 TGF—β1中和抗体可在蛋白质或mRNA水平逆转这种效应［4］。研究发现TGF—β1是致肾纤维化的核心因子，参与肾小球硬化的各个环节。活化的TGF-β1可能增加基质蛋白的合成（如胶原蛋白、FN、糖蛋白）和分泌，加强细胞黏附蛋白受体的转录、翻译和处理，减少基质降解蛋白酶的合成，增加这些蛋白酶特异抑制物的合成，从而对组织细胞的形态、增殖和分化过程起到重要作用［5，6］。郭鹏等［7］在糖尿病大鼠模型的 肾小球及肾小管中发现TGF—β1表达较正常组增加；Yamamoto等［8］测定53例不同肾病组织中 TGF—β1 mRNA水平时发现，微小病变肾组织的TGF-β1 m RNA表达与正常组织没有明显差异，而以ECM积聚为特征的DN、局灶节段增生性肾小球硬化、新月体性肾小球肾炎等的肾小球TGF—β1 m RNA水平显著增高。

本实验通过高糖培养HMCs，发现TGF—β1和FN的mRNA和蛋白表达较低糖对照组显著增加，这与以上的研究相一致。但Smad7的表达量却较低糖对照组减少。Smad蛋白是目前唯一所知的TGF-β胞 内 信 号 转 导 因 子，Smad7 在 TGF—β1／Smad信号转导通路中起主要的负反馈作用，是细胞中TGF-βⅠ型受体（TβRⅠ）丝氨酸／苏氨酸激酶的拮抗蛋白，能牢固地与TβRⅠ结合，使之无法将Smad 2／3磷酸化而阻断信号转导过程；另一方面，Smad7可阻止TGF-β依赖的Smad 2／4复合体的形成，从而抑制Smad2向细胞核转运，以减少Smad2介导启动的FN基因的表达；此外，Smad7还可募集Smad-泛素化调节因子（Smurf l和 Smurf 2）至TGF-β受体，促进TGF-β受体发生蛋白酶降解，从而发挥负调控作用［9］。Hong等［10］在研究db／db小鼠的TGF-β1／Smad信号转导通路时发现，与对照组相比，TGF-β1及TβRⅡ除在肾小球、肾小管表达增多外，smad2／3蛋白在其细胞浆及细胞核表达也增多，但Smad7表达却减少。本实验中HMCs在高糖刺激下，TGF-β1和FN表达增加，而Smad7表达减少，在同样以纤维化病变为特征的皮肤、肝脏、肺脏疾病中也发现Smad7表达的减少，结合前述的研究成果，笔者认为Smad7表达的减少在一定程度上导致了FN表达的增加，参与了DN的发生。对Smad7在DN中的表达变化进行深入研究，将进一步有助于阐明DN的发生机制，并在此基础上探寻新的防治DN的措施。

本文第一作者简介：

洪 练（1985～），女，汉族，硕士研究生，研究方向：糖尿病肾病的发病机制

1 Chan JC，Malik V，Jia W，et al.Diabetes in Asia：epidemiology，risk factors，and pathophysiology.JAMA，2009，301（20）：2 129～2 140.

2 Massague J，Chen YE.Controlling TGF-βsignaling.Genes De-velopment，2000，14（6）：627～644.

3 Van Det NF，Verhagen NA，Tamsma JT，et a1.Regulation of glomerular epithelial cell production of fibronectin and transfor-ming growth factor-βby high glucose，not by angiotensinⅡ.Dia-betes，1997，46（5）：834～840.

4 Sharma K，Jin Y，Guo J，et a1.Neutralization of TGF-βby anti-TGF-βantibody attenuates kidney hypetrophy and the enhanced extracellular matrix gene expression in STZ-induced diabetic mice.Diabetes，1996，45（4）：522～530.

5 尹永红，赵久阳，吕 申.糖尿病肾病中TGF-β的作用.国外医学泌尿系统分册，2005，25（5）：704～707.

6 Border WA，Noble NA.Transforming growth factor beta in tissue fibrosis.New England Journal Med，1994，331（19）：1 286～1 292.

7 郭 鹏，欧阳静萍，毛先晴.黄芪多糖对链唑脲霉素诱导的2型糖尿病大鼠肾脏 TGF-β1表达的影响.微循环学杂志，2007，17（2）：8～10.

8 Yamamoto T，Noble NA，Cohen AH，et al.Expression of transfor-ming growth factor beta isoforms in human glomerular diseases.Kid-ney International，1996，49（2）：461～469.

9 Inoue Y，Imamura T.Regulation of TGF-βfamily signaling by E3 ubiquitin ligases.Cancer Science，2008，99（11）：2 107～2 112.

10 Hong SW，Isono M，Chen S，et al.Increased glomerular and tu-bular expression of transforming growth factor-beta，its type l receptor，and activation of the Smad signaling pathway in the db／db mouse.Am J Pathol，200l，158（5）：1 653～1 663.

高糖培养人肾小球系膜细胞对TGF—β1、FN、Smad7表达的影响

洪 练，李 竞，高 凌，等／武汉大学人民医院内分泌科，武汉430060

目的：通过观察高糖对人肾小球系膜细胞（H MCs）转化生长因子—β1（TGF-β1）、纤维连接蛋白（FN）、Smad7表达的影响，探讨糖尿病肾病（DN）的发病机制。方法：将HMCs于高糖（30mmol／L）环境培养不同时间后，采用 RT-PCR方法检测TGF-β1、FN、Smad7 mRNA 表达，Western blotting检测Smad7蛋白的表达，采用ELISA检测TGF—β1、FN蛋白水平，同时以低糖培养作为对照组。结果：高糖培养24h、48h、72h后，TGF-β1mRNA及蛋白的表达均较低糖培养对照组增加，在48h时达到高峰；FN m RNA及蛋白的表达亦较对照组增加，且呈时间依赖性；而Smad7 mRNA及蛋白表达下降。结论：TGF-β1／Smad信号转导途径负反馈调节Smad7蛋白的表达减少，可能是DN发病过程中的重要环节之一。

Effect of High Glucose on Transforming Growth Factor-β1，Fibronectin and Smad7 Expression in Human Glomer-ulus Mesangial Cells

Hong Lian，Li Jing，Gao Ling，et al／Department of Endocrinology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060

Diabetic nephropathy； TGF-β1； Fibronectin；Smad7；Human glomerulus mesangial cell

R587.2 R692.6

A

1005—1740（2011）02—0013—04

武汉大学人民医院内分泌科，邮政编码 武汉430060； 通讯作者：李 竞，E-mail：lijing7823＠hotmail.com

book=2011,ebook=19

Objective：To explore the effect of high glucose on transforming growth factor-β1（TGF-β1），fibronectin（FN）and Smad7 expression in hu-man glomerulus mesangial cells（H MCs）.Method：HMCs were grown in DMEM medium containing 30mmol／L high glucose for some time（24h，48h，72h）.The expression of TGF-β1，FN，Smad7 mRNA were detected by RT-PCR and western blotting were used to detect the expression of Smad7 while the supernatant level of TGF-β1 and FN were detected by ELISA.Results：In HMCs induced by high glucose，the mRNA and pro-tein expression of TGF-β1 were improved and come to the most after 48h，the mRNA and protein expression of FN were up-regulated in a time-dependent manner，however Smad7 was down-regulated.Conclu-sion：High glucose can stimulate the expression of extracellular matrix excessively，to some degree，it may owe to the reduction of Smad7 which is a major I-Smad in TGF-β1／Smad signaling pathway.

糖尿病肾病 转化生长因子—β1 纤维连接蛋白 Smad7 人肾小球球系膜细胞／高糖培养