FAT10基因表达与结直肠癌患者临床病理因素及预后的关系

刘 蓓 王 琼 范 军 贺玉娟 付 军 孙幼芳 曾桃英

FAT10基因表达与结直肠癌患者临床病理因素及预后的关系

刘 蓓 王 琼 范 军 贺玉娟 付 军 孙幼芳 曾桃英

本文2010—11—05收到，2011—01—16修回，2011—03—11接受

结直肠癌（CCT）是最常见的恶性肿瘤之一。在消化道肿瘤中，其发病仅次于胃癌和食管癌而居第三位，在全球的发病率和死亡率呈上升趋势［1］。有研究报道，我国CCT也是由低发趋向于高发，统计资料显示，我国2005年CCT发病数和死亡数分别达17.2万和9.9万，已超过美国［2］。FAT10（Diubiquitin，双泛素）基因是近年来发现的与多种肿瘤的发生和发展密切相关的肿瘤相关基因，由165个氨基酸残基组成，属于泛素蛋白家族中的泛素样修饰蛋白（UBLs），分子量18 KD，由两个泛素样部分前后融合而成，它的N端有29%、C端有36%与泛素相同［3，4］。FAT10参与各种基本的细胞行为，包括信号转导、蛋白易位、细胞凋亡和细胞周期调控［5，6］。近来研究发现FAT10的表达上调参与了肿瘤的发生发展。Lee等［7］研究发现FAT10在肝癌、宫颈癌、卵巢癌等肿瘤组织中表达上调，提示FAT10在肿瘤发生、发展中起着重要的作用。本研究通过检测CCT样本FAT10基因m RNA的表达，分析FAT10表达与CCT患者临床病理资料之间的关系，旨在为CCT的预防、早期诊断提供理论依据，并为基因治疗提供新的靶分子。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集我院2000年5月31日～2003年5月31日CCT组织标本73例，患者年龄23岁～85岁，平均年龄55±6.8岁。按照2003年国际抗癌联盟（UICC）和美国肿瘤联合会（AJCC）联合制定的TNM分期法和改良DUKES分期法对CCT患者进行临床分级，其中临床分级I期和II期患者共39例，III期和IV期患者共48例，详细临床资料见表1。同时收集相同患者癌旁组织（TCT）和正常结直肠组织（NCT），所收集标本均在手术切除后30min内采集，随后迅速保存于液氮中备用。以上所有标本均经病理组织学确证。

1.2 组织总RNA提取

分别取适量保存于液氮中的CCT、TCT和NCT，在液氮中研磨成粉末状后，按照TrizolTM试剂盒（MBI公司）操作说明采用氯仿异丙醇法提取组织总RNA。所提取总RNA用适量无RNase去离子水充分溶解后，保存于—70℃备用。

1.3 RT-PCR

取适量提取的CCT、TCT和NCT总RNA，按照逆转录试剂盒（MBI公司）操作说明逆转录为cD-NA后，进行PCR扩增FAT10基因，扩增引物为：Forward-Primer 5'-AAA CAC AGC AAT CCA GGC A-3'，Reverse-Primer 5'-CCC GTC TTA GTC TCG ATC ATT-3'。以GAPDH为内参照，其扩增引物为：Forward-Primer 5'-ATG CTG GCG CTG AGT ACG T-3'，Reverse-Primer 5'-TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3'。以上引物均由上海生物工程有限公司合成，扩增片段大小分别为474bp和652bp。PCR扩增反应条件：95℃3min，94℃30s，56℃45s，68℃30s，共27个循环，最后68℃10min。PCR反应结束后，取适量PCR产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并摄像，然后进行灰度扫描，分析扩增片段灰度值，以FAT10表达灰度值与GAPDH表达灰度值比值为纵坐标，比较FAT10在CCT、TCT和NCT中的相对表达量。

1.4 统计学处理

以阳性率（%）计数FAT10 m RNA在CCT中的表达情况，采用Chi-square检验或Fisher确切概率法分析不同临床资料之间的差异。以均数±标准差（±s）表示FAT10 mRNA在CCT中的相对表达量，采用t检验分析FAT10 mRNA相对表达量在不同临床资料之间的差异。生存率采用Kaplan—Meier法计算，生存期差别的比较采用Log-Rank（Mantel-Cox）时序检验。以上所有统计学分析均采用SPSS11.0统计学软件进行处理。

2 结 果

2.1 FAT10在CCT组织中的表达

提取CCT总RNA后，紫外分光光度计测定其A260／A280，其比值在1.8～2.0之间，说明提取的总RNA质量良好。RT-PCR后2.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，FTA10 m RNA在73例CCT、TCT和NCT中有不同程度的表达（图1A）。进一步分析FAT10相对表达量，发现在CCT中的相对表达量（0.664±0.042）明显高于 TCT（0.525±0.037）（P＜0.05），而TCT中的FAT10相对表达量明显高于 NCT（0.377±0.029）（P＜0.05）（图1B）。

图1 FAT10 mRNA在CCT组织中的表达

2.2 各种临床病理因素对FAT10阳性表达的影响

本研究收集的73例CCT标本中，6例因临床资料不完善而不进行此次分析。67例CCT患者详细临床资料与FAT10阳性表达情况见表1。分析发现，FAT10在CCT的阳性表达率为52.24%（35／67），其中有淋巴结转移的CCT的阳性率明显高于未见淋巴结转移者（P＜0.05）。TNM分级III＋IV级CCT的阳性表达率明显高于I＋II级者 （P＜0.05）。CCT患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤临床进展、分化程度等对FAT10的阳性表达率无明显影响（P＞0.05）。

表1 各种临床病理因素对FAT10 mRNA阳性表达率（n，%）的影响

2.3 各种病理因素对FAT10相对表达量的影响

FAT10在有淋巴结转移的CCT中的相对表达量明显高于没有发生淋巴结转移者（P＜0.01）。TNM分级为III＋IV级CCT患者的FAT10相对表达量明显高于I＋II级（P＜0.01）。而CCT患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤临床进展、分化程度等对FAT10的相对表达量无明显影响（P＞0.05）。

表2 多种临床病理因素对FAT10 mRNA相对表达量的影响（±s）

表2 多种临床病理因素对FAT10 mRNA相对表达量的影响（±s）

临床病理因素 FAT10 mRNA阳性例数 相对表达量t P 值年龄（岁）＜50 8 0.59±0.04 1.79 ＞0.05≥50 27 0.62±0.03肿瘤大小（cm）＜5 15 0.60±0.04 0.45 ＞0.05≥5 20 0.60±0.02肿瘤进展早期 8 0.63±0.03 1.48 ＞0.05中晚期 27 0.62±0.04分化程度高分化或中分化 6 0.57±0.03 1.04 ＞0.05低分化或未分化 29 0.58±0.02淋巴结转移有27 0.70±0.03 14.38 ＜0.01无8 0.52±0.02远处转移有11 0.63±0.02 1.30 ＜0.05无24 0.61±0.03 TNM分级I＋II 8 0.54±0.04 8.48 ＜0.01 III＋IV 27 0.67±0.03

2.4 FAT10表达与术后生存率的关系（Kaplan-Meier生存分析）

截止到2010年4月，67例CCT患者均有5年以上完整随访资料。31例CCT患者在术后5年随访期间死于CCT复发。FAT10表达阴性患者平均生存期为49.4月，而FAT10表达阳性患者的平均生存期为29.7月，后者明显低于前者，两组生存率差异显著（Chi-square＝7.21，P＜0.05）。见图2。

图2 FAT10 mRNA表达与CCT患者生存时间的关系

3 讨 论

FAT10属于泛素蛋白家族中UBLs家族的成员之一，许多上皮源性肿瘤中表达上调，在细胞分裂前、中期通过干扰着丝粒的定位导致细胞染色体不稳定性增加［8］。FAT10主要在胞核中表达，提示其有可能通过参与细胞周期的调节而参与肿瘤的发生、发展［9］。

Caroline等［10］研究发现90%肝癌患者FAT 10蛋白表达水平上调，同时，FAT 10蛋白表达水平在胃癌、CCT等胃肠道肿瘤及妇科生殖系统肿瘤中也上调。Lim等［11］研究发现FAT10 mRNA在结肠癌、肝癌等细胞系中表达上调，在胃癌、结肠癌等胃肠道肿瘤及妇科生殖系统肿瘤中也上调，这种表达上调主要出现在处于细胞周期的S细胞，提示FAT 10可能通过调节细胞周期G2／M期促进肿瘤细胞的生长。

本实验采用RT-PCR方法检测CCT中FAT10 mRNA的表达，发现CCT组织FAT10 mRNA的阳性表达率为52.24%，明显高于NCT和TCT，与有关报道［2］相一致，提示FAT10在CCT的发生发展中可能起着重要的作用。进一步分析发现，FAT10的阳性率与CCT淋巴结转移及CCT TNM分级有关，而与肿瘤大小、大体类型和分化程度无显著关系，提示FAT10参与了CCT的局部转移，说明FAT10可能与CCT的发生、发展密切相关。

分析FAT10的表达与CCT患者生存期之间的关系时发现，FAT10表达阴性患者平均生存期为49.4月，而FAT10表达阳性患者的平均生存期为29.7月，提示FAT10的高表达可能与患者生存相关。进一步进行 Kaplan-Meier生存分析显示，FAT10表达阳性组生存率明显低于FAT10表达阴性组（P＜0.05），提示FAT10的表达有可能是CCT患者预后监测的指标之一。

通过对FAT10基因的深入研究，探讨其在CCT发生、发展中的作用，提示FAT10有可能成为CCT一个新的肿瘤标志物而用于CCT的预后监测。关于FAT10在CCT中的发生机理、诊断及预后价值、治疗作用等尚需进一步研究。

本文第一作者简介：

刘 蓓（1976～），女，汉族，主治医师，硕士，主要从事肿瘤免疫学方面的研究

1 Smith RA，Cokkinides V，Brawley OW.Cancer screening in the united states，2008：a review of current american cancer society guidelines and cancer screening issues.CA Cancer J Clin，2008，58（3）：161～179.

2 宋 武，何裕隆，蔡世荣，等.结直肠腺癌病理分型的临床意义及预后分析.中华消化杂志，2009，29（4）：249～253.

3 Ren J，Kan A，Leong SH，et al.FAT10 plays a role in the regu-lation of chromosomal stability.J Biol Chem，2006，281（16）：11 413～11 421.

4 Schmidtke G，Kalveram B，Weber E，et al.The UBA domains of NUB1L are required for binding but not for accelerated degra-dation of the ubiquitin-like modifier FAT10.J Biol Chem，2006，281（29）：20 045～20 054.

5 Snyder A，Alsauskas Z，Gong P，et al.FAT10：a novel mediator of Vpr-induced apoptosis in human immunodeficiency virus-asso-ciated nephropathy.J Virol，2009，83（22）：11 983～11 988.

6 Gong P，Canaan A，Wang B，et al.The ubiquitin-like protein FAT10 mediates NF-kappaB activation.J Am Soc Nephrol，2010，21（2）：316～326.

7 Lee CG，Ren J，Cheong IS，et al.Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gas-trointestinal and gynecological cancers.Oncogene，2003，22（17）：2 592～2 603.

8 Zhang，SH，Xu，AM，Chen，XF，et al.Clinicopathologic signif-icance of mitotic arrest defective protein 2 overexpression in hep—atocellular carcinoma.Hum Pathol，2008，39（12）：1 827～1 834.

9 Ross MJ，Wosnitzer MS，Ross MD，et al.Role of ubiquitin-like protein FAT10 in epithelial apoptosis in renal disease.J Am Soc Nephrol，2006，17（4）：996～1 004.

10 Oliva J，Bardag-Gorce F，French BA，et al.Fat10 is an epige-netic marker for liver preneoplasia in a drug—primed mouse mod-el of tumorigenesis.Exp Mol Pathol，2008，84（2）：102～112.

11 Lim CB，Zhang D，Lee CG.FAT10，a gene up-regulated in va-rious cancers，is cell-cycle regulated.Cell Div，2006，1：20.

FAT10基因表达与结直肠癌患者临床病理因素及预后的关系

刘 蓓，王 琼，范 军，等／武汉科技大学附属天佑医院病理科，武汉430064

目的：探讨结直肠癌（CCT）组织中FAT10（Diubiquitin，双泛素）的基因表达与其病理因素及预后的关系。方法：收集我院2000～2003年73例有5年以上完整随访资料的结直肠癌术后患者，采用RT-PCR方法检测FAT10 mRNA在CCT、癌旁组织（TCT）和正常结直肠组织（NCT）中的表达情况，并分析临床病理因素对FAT10阳性表达率和相对表达量的影响，以及FAT10表达与预后的关系。结果：FAT10 mRNA在CCT阳性表达率为52.24%（35／67），且在CCT的相对表达量（0.735±0.034）明显高于 TCT（0.561±0.044）和 NCT（0.397±0.028）（P＜0.05）；FAT10 mRNA的阳性表达率及相对表达量受临床进展、淋巴结转移和TNM分级的影响较明显（P＜0.05），而患者年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度等对其无明显影响（P＞0.05）；Log-Rank检验显示CCT患者中，FAT10表达阳性者生存率明显低于FAT10表达阴性者（P＜0.01）。结论：FAT10在CCT的表达状况与CCT转移及预后关系密切，可以作为反映生物学行为和判断预后的有效指标。

Analysis the Relatvie of FAT10 Expression with Clinico-pathological Features and Prognosis of Colorectal Canc-er

Liu Bei，Wang Qiong，Fan Jun，et al／Department of Pathology，Affiliated Tianyou Hospital of Wuhan Uni-versity of Science and Technology，Wuhan，430064

FAT10 gene；Colorectal cancer；Prognosis

R364.3

A

1005—1740（2011）02—0019—04

武汉科技大学附属天佑医院病理科，邮政编码 武汉430064；通讯作者：曾桃英，E-mail：liubei1976＠126.com，Tel：027-51164947

Objective：To investigate the relationship between expression of FAT10 in colorectal cancer and its clinicopathologic significance.Method：Collected 73 cases in 2000～2003 in our hospital over 5 years follow-up data complete the colorectal cancer patients using RT-PCR to detect FAT10 mRNA expression in colorectal cancer tissues and tumor adjacent tissue，the normal colon tissue as control，and relation of FAT10 expres-sion with clinicopathological features and clinical outcomes of colorectal cancer patients were analyzed.Results：The intensive positive rate of FAT10 mRAN expression in colorectal cancer was 52.24%（35／67）.Ex-pression of FAT10 was significantly correlated with lymph node metasta-sis and clinical stage and TNM staging（P＜0.05），but not with age，tumor size and tumor differentiation，etc.（P＞0.05）.In the intensive positive rate of FAT10 expression in colorectal cancer，the survival rate was significantly lower than negative ones（P＜0.01）.Conclusion：Over-expression of FAT10 in patients with colorectal cancer enhances the pos-sibility of invasion and metastasis，implying a poor prognosis.FAT10 may serve as fairly a good prognostic factor to indicate biologic behavior and prognosis in colorectal cancer.

FAT10基因 结直肠癌 预后

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