PCR-SSP法在强直性脊椎炎患者中HLA-B27的诊断作用

周建月,田晓丰（.广西医科大学第一附属医院输血科,广西南宁 53002;2.吉林大学普外科中心,吉林长春 3004）

*通讯作者

HLA-B27是人类白细胞抗原B位点上的一个重要的等位基因,与脊椎关节系统疾病如强直性脊柱炎（AS）、反应性关节炎（ReA）、Reiter氏综合征（RS）等许多严重危害人类健康的疾病密切相关。HLAB27的检测有血清学检测和PCR技术检测两种,我们对疑为强直性脊椎炎患者的HLA-B27进行了两种方法的检测,报告如下。

1 材料和方法

1.1 标本来源 36例广西省各医院可疑强直性脊椎炎患者标本。

1.2 HLA-B27血清学分型 取患者EDTA抗凝全血3.5ml,其中3 m l用于微量淋巴细胞毒试验检查HLA-B27抗原,预留0.5m l用于DNA的提取。检定血清板含有阳性对照、阴性对照及4份抗B27血清。

1.3 HLA-B27 PCR-SSP基因检测

1.3.1 制备DNA模板 用预留的0.5 ml全血采用快速盐析法提取DNA,5μl纯净水溶解。

1.3.2 HLA-B27 PCR引物设计根据HLA-B27基因序列设计引物为5'-CAGTCTGTGCCTTGGCGTTGC-3';5'-GGCTACGTGGACGACACGCT-3',PCR产物为144 bp。内对照为人类生长激素（HGH）基因特异性引物,HGH-A链引物序列为:5'-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3',HGH-B链引物序列为:5'-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTG-3',扩增产物为434 bp。

1.3.3 PCR扩增体系为50μl:DNA Taq酶0.5u,10×PCR buffer 5μl,dNTP:1mM,每条引物终浓度 1μM和DNA 2μg;循环参数为 94℃,5 min;94℃,30 s;60℃,30 s;72℃,50 s;30个循环后72℃,5 min结束扩增后2%琼脂糖电泳30 min后,凝胶成像记录结果。

2 结果

2.1 血清学检测结果 36份标本血清学检测出17份HLA-B27抗原阳性,14份HLA-B27抗原阴性,5份血清学结果可疑。

2.2 PCR检测结果 有美国G&T提供4份含有HLA-B27基因的DNA标准品和4份无HLA-B27基因的DNA标准品作为扩增判定标准。检测有HLAB27基因的,出现434 bp内对照带和144 bp特异性带。检测没有含有HLA-B27基因的,仅出现434 bp内对照带,不出现144 bp特异性带。同次扩增DNA标准品结果正确无误。36份标本均重复2次,检测结果一致。如图1所示。

2.3 PCR检测结果中20例有HLA-B27基因,其中17例是血清检测阳性结果样本,另3例是血清学检测结果可疑样本。16例无HLA-B27基因,其中14例是血清检测阴性结果样本,另2例是血清学检测结果可疑样本。

图1 HLA-B27 PCR扩增结果示意图

2.4 本试验36例样本 以PCR-SSP技术检测有HLA-B27基因者20例,其中19例样本达到AS临床诊断标准,1例不能确诊为AS。

3 结论

AS是一种主要侵犯脊柱并可不同程度累及骶髂关节和周围关节的慢性进行性炎性疾病,HLAB27抗原与AS具强相关性[1],HLA-B27阳性在AS的诊断中具有较高的价值。廖艳秋[2]等认为,如果病人诊断AS的可能性为50%,若病人B27阳性,则诊断AS的概率提高到95%左右,若该患者B27阴性,则患AS的概率降至3%左右。所以能否正确判定HLA-B27抗原对于诊断非常重要。采用血清学检测的缺点是:要求新鲜血至少3ml及足够量的活淋巴细胞。难以获得强度为100%的HLA-B27单抗血清,不同厂家的抗血清质量难以统一,不同批号之间存在亚型特异性等诸多问题。几份血清血检测结果不一致时难以下结论,对于这样的可疑样本人为主观判断因素影响大。而PCR检测技术对样本要求不高,血样或提取的DNA均可长期保存,便于重复检测。PCR操作简便、结果可靠,准确性和重复性强。对于HLA-B27的检测用PCR方法优于血清学方法。

[1][1]Mcmichel A,Bell J.HLA-B27:a disease-associated immune response gene[J].Res Immunol,1991,142:475.

[2]廖艳秋,陶良军,王红梅,等.HLA-B27的检测极其临床意义的探讨[J].中国输血杂志,2001,14（6）:373.