肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对胶质瘤细胞的诱导凋亡作用

严 海,张 宇,于洪泉*,齐 玲,金 宏,姜亚磊,胡晓勇

（1.北华大学第二临床学院脑外科;2.吉林大学第一医院神经外科,吉林长春 130021;3.吉林医药学院病理教研室）

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）可以诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,并且对正常细胞没有明显的毒性作用,因此在美国已进入临床Ⅱ期药物开发阶段[1]。胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的脑肿瘤,除手术切除外,现有放、化疗等方法对于患者生存期的延长意义不大。国外已有TRAIL可以诱导多种胶质瘤细胞凋亡的报道[2],国内未见同类报道。因此,我们提出对原代培养的胶质瘤细胞经TRAIL诱导凋亡作用进行研究,为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养[3]取新鲜人脑胶质瘤组织（吉林大学第一临床医院提供,病理诊断为Ⅲ-Ⅳ级脑胶质瘤）。去除坏死、出血部分。冷PBS冲洗后将组织剪成小块（1mm×1mm大小）,置于离心管中,加入0.25%胰酶,37℃振荡孵育30-45 min,离心弃上清,培养液重悬细胞,计数活细胞,加入 10%DMEM/F12（Gibco）培养液,以1×106/75 cm2密度接种,将培养瓶置入37℃、5%CO2孵箱、饱和湿度下进行培养,隔日换液,1∶3传代。

1.2 TRAIL对胶质瘤细胞诱导凋亡作用[4]细胞融合至85%,0.25%胰酶消化,计数活细胞,以每孔8×103个细胞接种于 96孔板中,培养24 h,将细胞分为4组,加入TRAIL（100 ng/ml）,对照组使用基础培养基。作用24 h后,小心弃上清,PBS洗去培养基,每孔加入酸性磷酸酶底物检测溶液（用对硝基苯新鲜配制）100μl,继续培养90min,加入终止液,室温下孵育5min。酶标仪405 nm处测定各孔光吸收值。

2 结果

2.1 胶质瘤细胞生长情况 胶质瘤细胞经酶消化分离后培养,细胞生长情况良好,镜下观察2 h细胞开始出现贴壁生长,12 h左右大部分细胞均已发生贴壁,仅有少量细胞发生死亡,细胞伸展,在细胞的两极开始出现突起,胞体呈长椭圆形,也可见其他不同形态的细胞。

2.2 TRAIL诱导胶质瘤细胞凋亡情况 取获得的三株原代培养胶质瘤细胞株,未加TRAIL的对照组结果分别为0.23±0.02,0.51±0.02,0.36±0.01;经TRAIL作用后,测定结果分别为0.24±0.01,0.12±0.01,0.22±0.01。在三株原代培养的脑胶质瘤细胞中,GC321和GC125对两株细胞对TRAIL的敏感性较高,结果有显著性差异（P＜0.01）,而GC417则表现为稍有增殖（见表1）。

表1 TRAIL作用于胶质瘤细胞诱导凋亡情况（±s±s）GC417 GC321 GC125对照组 0.23±0.02 0.51±0.02 0.36±0.01 TRAIL组 0.24±0.01 0.12±0.01* 0.22±0.01*与对照组相比:*P＜0.01

3 讨论

胶质瘤是起源于中枢神经系统的最常见肿瘤,其发病率并不高,但由于其隐匿性,一经发现病理诊断就是Ⅲ-Ⅳ胶质瘤,其死亡率极高。并且由于在脑内呈弥散分布[5],手术难以清除,即使清除,也由于散布有肿瘤细胞,使胶质瘤易复发。TRAIL研究过程中遇到过很多问题,但它作为体内免疫系统可以正常表达的产物[6],一直倍受关注。

人们想通过一种天然物质或天然抗肿瘤机制的研究,找到一种理想的肿瘤治疗新药。TRAIL研究中发现,它可以诱导多种肿瘤细胞发生凋亡[7],但同时在多种肿瘤来源的细胞株中也广泛存在着药物耐受和抵抗现象[8],并且到目前为止,科研人员还在对抵抗或耐受的机制研究做着不懈的努力。由于大部分的研究都是针对已获得的肿瘤细胞株,但对于从病人获得的原代培养的细胞株,国内研究还较少,因此,我们从临床上获得脑胶质瘤组织,分离出胶质瘤细胞,对TRAIL进行研究。

结果发现,虽然同为原代培养的胶质瘤细胞,但三株细胞TRAIL的反应也不相同,有一定差异。其中,GC417对TRAIL完全不敏感,甚至在100 ng/m l TRAIL作用后,细胞仍出现轻微的增殖反应。而GC321则对TRAIL非常敏感,在100ng/ml TRAIL作用后,出现明显的细胞凋亡反应。而GC125介于两者之间。这说明,不同来源的胶质瘤细胞对TRAIL的反应性不同,但是什么原因导致了细胞对TRAIL的反应不同,还需要进一步研究,并明确在细胞中,决定药物敏感性的因素。

[1]Anita C,Ling Qi,Patrick Mulligan,etal.TRA ILAgonistsonClinical Trials for Cancer Therapy:The Promises and the Challenges[J].Reviewson RecentClinical Trials（Online）.2009,（4）:34.

[2]Song JH,Bellail A,TseMC,etal.Human Astrocytes Are Resistant to Fas Ligand and Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand-Induced Apoptosis[J].Neuroscience.2006,26（12）:3299.

[3]齐 玲,金 宏,丁丽娟,等.脑肿瘤干细胞的培养及生物学特性研究[J].中国实验诊断学.2011,15（2）:227.

[4]毕莉莉,齐 玲,李景辉,等.老年脑萎缩患者血清中TNF表达[J].中国实验诊断学.2011,15（2）:335.

[5]Holland EC,G lioblastomamultiforme:the term inator[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97（12）:6242.

[6]Smyth MJ,Takeda K,Hayakawa Y,et al.Nature's TRAIL-on a path to cancer immunotherapy[J].Immunity.2003,18（1）:1.

[7]Griffith TS,Anderson RD,Davidson BL,et al.Adenoviral-mediated transfer of the TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2 ligand gene induces tumor cell apoptosis[J].JImmunol.2000,165（5）:2886.

[8]Guo L,Fan L,Pang Z,et al.TRAIL and doxorubicin combination enhancesanti-glioblastoma effect based on passive tumor targeting of liposomes[J].JControl Release.2011.[Epub ahead of print].