肠出血性大肠杆菌O157:H7研究进展

孟祥升，辛崇兴，邵 晞

（江苏省连云港市动物卫生监督所，江苏连云港 222001）

肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7 于 1982 年在美国被首次发现，此后在世界各地散发或地方流行，1996年在日本大阪地区发生流行，患者逾万，死亡11人，1999—2000年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染O157:H7事件，导致l77人死亡[1-2]。世界卫生组织已将O157:H7列为新的食源性病原菌。O157:H7的感染因具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，已成为全球性的公共卫生问题，因此对该菌进行有效的防控研究成为当前亟需解决的问题。

1 病原学

EHEC O157:H7具有一般大肠杆菌的形态特征，为革兰氏阴性、无芽孢的直杆菌，两端钝圆，散在或成对，大多数菌株以周生鞭毛运动，但也有无鞭毛或丢失鞭毛的无动力变异株。在普通营养琼脂培养基上O157:H7表现为光滑型菌落，有光泽，湿润，灰白色。最适宜生长的温度为37℃，超过44.5℃不能生长，在75℃一分钟即可被杀灭，但其致病因子志贺毒素的抗力却很高，经80℃处理30 min仍具有活性。相对耐酸和耐冷，能在pH值为2、温度低于5℃的环境中生存，在-20℃可存活9个月。此外，对含氯消毒剂十分敏感，在有效氯含量0.4ppm以上的水体中难以存活。

EHEC O157:H7与一般大肠杆菌的基本生化特性相符，发酵多种碳水化合物，但迟缓发酵山梨糖醇，也不能产生葡萄糖酸苷酶。但目前已有发酵山梨醇、产β-葡萄糖醛酸苷酶的产毒性O157:H7分离株的报道。Krishnan[3]和Haldane[4]分别报道的24株和37株O157:H7菌的生化结果，其山梨醇均为阴性，而赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、棉子糖和卫矛醇均为阳性，故以这5种生化特性作为O157:H7与普通大肠杆菌的鉴别要点。但叶青分离的O157:H7中2株为山梨醇阳性、棉子糖阳性，1株卫矛醇阳性[5]。以上研究结果表明部分菌株已产生变异，其生化反应也不完全一致。

2 流行病学

EHEC O157:H7感染是一种动物源性传染病，奶牛，尤其是放牧的小牛是其主要储存宿主，从腹泻患者、畜禽粪便、市售肉类以及猪、鸽、鸡、鸭等动物中也有分离到O157:H7的报道[6]。EHEC O157:H7的流行也与季节有关，主要发生在夏秋两季，春冬季发病相对较少，7月到8月为发病高峰期，此外，雨季也是感染的易发季节。

EHEC O157:H7可通过多种途径传播，其中以食源性传播为主，水源性传播和接触传播也是重要的传播途径。O157:H7具有较强的感染力，一般大肠杆菌需要100万个活菌才可引起发病，而O157:H7只需100到200个活菌即可突破胃酸屏障，引发感染。各年龄段人群对O157:H7都易感，但儿童和老年人最易发病且症状较为严重，容易并发溶血性尿毒综合症和血小板减少性紫癜。根据现有的报道分析，患病后人体可产生免疫力，但其持续的时间较短。

3 临床症状

牛是EHEC O157:H7的主要携带者，但成年牛一般不会发病，并且没有临床症状，只有犊牛才会出现腹泻症状。猪感染该菌后可导致水肿病，以头部，肠系膜和胃壁浆液性水肿为主要特征，且常伴有共济失调，麻痹或惊厥等神经症状，发病率较低但死亡率很高。对死亡小鼠进行剖检可见整个肠道肠壁菲薄，透明肿大有气泡，充血、出血，充满黄色液体，其中尤其以十二指肠最为严重；肝脏灰白色点状坏死，周边淤血；心、肺、脾、肾点状出血等。

人对EHEC O157:H7普遍易感。流行病学统计研究表明该病的潜伏期通常为3~4 d，短则1~2 d，长则5~8 d，多数出血性结肠炎患者发病后10 d内即可自愈。临床资料统计表明，EHEC O157:H7感染患者大多急性发病，常突然发生剧烈腹痛和非血性腹泻，数天后出现血性腹泻，低热或不发热。表现为水样便、粘液便或脓血便，在有的病例中，取得的粪便样品甚至是“只有血没有粪渣”，可见出血性腹泻的程度。

4 检测方法

EHEC O157:H7感染已成为全球性的公共卫生和食品安全问题，对其进行快速、特异的检测对于该病的早期诊断及疫情有效控制至关重要。生物技术的发展为EHEC O157:H7的实验室诊断提供了许多有效的手段和方法。

4.1 细菌分离法

国内有报道称可以使用显色培养基对EHEC O157:H7进行初筛，目前常规使用山梨醇麦康凯琼脂培养基（SMAC）对菌株进行分离和筛选，在正常条件下，EHEC O157:H7不能发酵山梨醇，在SMAC琼脂上呈现为无色或者灰色菌落，而其他大肠杆菌则呈红色菌落[7]。但有一些其他血清型的O157和变形菌、毗邻单胞菌属、摩根菌属和爱德华菌属等革兰氏阴性菌也不发酵山梨醇。后又根据头孢克肟抑制变形菌，O157型菌株不能发酵鼠李糖，而60%的山梨醇阴性的其他O157发酵鼠李糖等而制备了头孢克肟-鼠李糖-山梨醇麦康凯培养基（cefixime rhamnse sorbitol MaConkey agar CR-SMAC），提高了分离的敏感性。

4.2 血清学检测方法

EHEC O157:H7经初步分离培养后需要进一步通过血清学实验进行鉴定，目前常用的血清学诊断方法有玻片凝集试验、乳胶凝集试验和ELISA法等。玻片凝集试验常常出现假阴性的结果。乳胶凝集试验可以直接从厂家购买乳胶凝集试剂盒按两步法进行检测，具体步骤为挑取分纯的菌株分别与O157、H7诊断血清做凝集试验。凡与O157单克隆抗体凝集达++以上者，再用H7血清凝集。若H7鞭毛抗原发育不良，可用0.3%~0.4%半固体琼脂做U型管诱导鞭毛产生，然后再进行凝集，凝集++以上者可初步判定为EHEC O157:H7菌株。目前实验室最常用的血清学检测方法是ELISA法，利用全菌体、LPS和Stx等抗原检测血清中相应的抗体水平。宿主感染EHEC后，一般都会诱发抗LPS抗体，所以在血清学检测上，一般都是检测抗LPS的抗体。

4.3 免疫学检测方法

4.3.1 免疫磁珠法 基本操作是先将标本进行选择性增菌，然后加入EHEC O157:H7抗体包被的磁珠，37℃振摇培养30 min，再用磁板将免疫磁珠沉淀，从而分离得到EHEC O157:H7。

4.3.2 蛋白芯片检测法 基本操作是首先将抗原（或抗体）固定于膜、载玻片等载体上制成检测用芯片，然后用该芯片去捕捉待检样品中的特异性抗体（或抗原），最后加入荧光标记的二抗，经激光共聚焦扫描仪或荧光扫描仪扫描，记录芯片上各点的荧光强度，从而对样品进行判定。

4.3.3 胶体金免疫层析试纸检测法 当前国内外多以双抗体夹心法检测样品中的EHEC O157:H7菌体（O）抗原。用胶体金标记抗EHEC O157:H7的单克隆抗体，然后与样品中的EHEC O157:H7结合，形成双抗体夹心结构，呈现出肉眼可见的红色条带。该法灵敏度高、特异性强，操作简便、快速，结果准确、易于判读。

4.4 分子生物学检测法

4.4.1 PCR技术 目前常用的PCR技术为实时荧光定量PCR，该PCR法：除具有比常规PCR更好的特异性和敏感性外，还能对样本进行定量，准确反应出污染或感染的强度，在病原体检测中显示出很强的优势。Karen[8]等在FQ-PCR的基础上建立了目的基因为stx1、stx2和uidA的检测EHEC O157:H7多重实时荧光PCR方法，敏感性达到98.6%，特异性100%，具有较好的应用前景。

4.4.2 基因芯片技术 基因芯片技术又称为DNA芯片技术，是近年来分子生物学及医学诊断技术的重要进展，该技术能高效大规模的获取相关的生物信息，是一种重要的基因检测手段。Call等[9]将EHEC O157:H7 编码 Intimin，Stx1，Stx2 和 HeamolysinA 等4种毒力因子的25~30 mer寡核苷酸探针固定在玻片上，模板DNA可直接与之杂交。与普通凝胶电泳法相比该方法灵敏度提高了30倍，能够检测小于1个细胞的基因组DNA量的PCR扩增产物（1fg）。

4.4.3 生物传感器技术 生物传感器是将生物芯片和传感技术结合在一起的产物，是现代科技的前沿技术之一，具有选择性高、分析速度快、操作简易和价格低廉等特点，可以进行在线或活体分析。Demarco[10]设计制造了一种消散波光纤生物传感器，利用该生物传感器分别检测l0 g和25 g碎牛肉样品中的细菌污染情况。结果显示l0 g样品的检测灵敏度为5.2×102cfu/g，25 g样品的检测灵敏度为9.0×103cfu/g，并且在处理样品的25 min中内没有出现任何假阳性结果。该方法灵敏、重复性好，特异性也较为理想。

5 防控策略

近年来世界各地EHEC O157:H7的流行范围不断扩大，受到世界各国卫生组织的高度重视。目前，对EHEC O157:H7的自然携带宿主及该菌引起的感染尚缺乏有效的防治手段，国家卫生部规定EHEC O157:H7感染患者和疑似病人禁止使用抗生素进行治疗。临床研究证明，用磺胺类和内酰胺类抗生素对EHEC O157:H7感染患者进行治疗，会增加患者并发HUS的危险性[11]。因此对该菌的防控就显得尤为重要，除消灭传染源、切断传播途径外，近年来EHEC O157:H7疫苗的研究对该病的防控也起到了重要的作用。

5.1 消灭传染源

牛和其他少数反刍动物是EHEC O157:H7的主要的储存宿主，从猪、鸽、牛、鸡、鸭等动物中也有分离到EHEC O157:H7的报道。一些方法已被用于减少该菌在牛肠道中的定居，如调整饲料配比、应用微生态制剂以及使用噬菌体消灭该菌等。由于该菌引起的感染大多由环境污染而来，所以对带菌动物排泄物的处理也十分重要。通过发酵粪便的方法杀灭EHEC O157:H7，能大大降低其存活数量。

5.2 切断传播途径

由于人与带菌动物接触也会导致EHEC O157:H7的感染，所以农场的工作人员及其他与之有接触的人员应采取适当的防护措施，并注意个人卫生，不在饲养动物的地方用餐。避免粪便污染水源，保持水源清洁。在食品加工、零售的各个环节要严格遵守食品卫生法规，并要加强对动物性食品的微生物学检测。

5.3 免疫预防

研究表明，EHEC O157:H7被巨噬细胞吞噬后并不能在短时间内被消灭掉，在这段时间内，Stx在菌体内的表达量反而会迅速增加，该菌被溶酶体裂解后，产生的Stx又会被巨噬细胞释放出来，同时巨噬细胞产生的炎性细胞因子、IL和TNF等也会一起被释放出来，导致病理反应的增强[12]。因此，有效的免疫预防是控制EHEC O157:H7感染的最好策略，其中疫苗接种为免疫预防的重要手段之一。目前对EHEC O157:H7疫苗的研究主要集中在多糖结合疫苗、亚单位疫苗、转基因植物疫苗、细菌ghost疫苗、减毒活菌苗和重组载体活菌苗等几个方面，一些疫苗已取得了重大进展，进入临床实验阶段。但EHEC O157:H7疫苗真正应用于临床免疫防治还有待时日，许多问题有待解决，如筛选最佳抗原或抗原组合、寻找高效、安全的佐剂或研制不需要佐剂的疫苗和建立更接近人体免疫状况的动物模型等。相信经过科研人员的不懈努力，用疫苗来防治EHEC O157:H7的感染将变为现实。

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