遗传密码扩充技术在蛋白质研究中的应用进展

刘亚光，方正之，姚文兵

(中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

遗传密码扩充技术在蛋白质研究中的应用进展

刘亚光，方正之，姚文兵

(中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

生命科学发展需要获得进化的蛋白质来满足科学研究的需要，在蛋白质中引入非天然氨基酸从而赋予其更多的功能成为蛋白质进化的一个重要手段。一项遗传密码扩充技术很好的实现了在体内定点引入非天然氨基酸，这项技术的关键是获得一对正交的氨酰tRNA合成酶/tRNA分子对，利用其高特异性反应将非天然氨基酸定点引入蛋白质分子中。迄今为止，几十种非天然氨基酸通过此方法被中引入到蛋白质中，从而打开了蛋白质研究的新天地。本文介绍了这项技术的基本原理，并对其在蛋白质修饰、结构和功能研究、以及在药用蛋白中的应用进展进行了综述。

蛋白质进化;非天然氨基酸;定点引入;遗传密码扩充;氨酰tRNA合成酶/tRNA分子对

生物体内所有蛋白质都是由三联密码子编码的20种天然氨基酸所组成的，这些天然的氨基酸只含有一些有限的功能基团如羟基、羧基、氨基、烷基和芳香基团等。随着生命科学的发展，通过翻译后修饰的研究以及“第21种氨基酸”硒代半胱氨酸和“第22种氨基酸”吡咯赖氨酸的发现及应用，可以赋予蛋白质一些新的生物学功能［1－2］。然而随着现代科学的发展，天然蛋白质已无法满足人们对于蛋白质更深层研究的需求，所以必须寻求一种系统扩展遗传密码的方法使蛋白质乃至整个生物体得以进化，从而赋予蛋白质新的物理、化学或生物学特性，便于人们更好的操控蛋白质的结构与功能。

目前，蛋白质的制备方法主要有3种:生化提取法、基因工程法和化学合成法，但由于其各自的局限性无法获得满意的蛋白质突变体［3－5］。近年来，由美国 Scripps实验室的 Peter博士领导的团队报道了一种可以在生物体内编码合成含有UAA蛋白质的方法－遗传密码扩充技术，为蛋白质进化提供了新的思路［6］。

1 遗传密码扩充技术的原理

利用该技术在生物体内表达含有UAA的蛋白质需要包括一些新的作用元件:特异性对应UAA的密码子(unique codon)、特异性识别上述密码子的新 tRNA(suppressor tRNA)及其对应的氨酰tRNA合成酶(aminoacyl－tRNA synthetase，aaRS)，这些元件在蛋白质翻译过程中必须保证正交性从而使UAA被引入到蛋白质的特定位置上。

新的aaRS必须只识别对应的新tRNA而不能识别宿主菌内任何内源性tRNA;新tRNA必须特异性识别UAA对应的密码子而且不能被内源性aaRS氨酰化;并且UAA和其对应的aaRS必须与天然氨基酸和其对应的内源性合成酶没有交联反应。换言之，这种新aaRS只能催化相应的新tRNA与UAA的氨酰化反应，否则非天然的和天然的氨基酸都会被引入到蛋白质特定位点上而导致特异性降低［7］;另外，UAA不能是任何内源性合成酶的底物，否则局部的UAA取代将会遍布整个蛋白质组。

通过遗传密码扩充技术，可以在大肠杆菌［8］、酵母［9］和哺乳动物细胞［10］中直接编码UAA，通过特定的密码子，已有数十种UAA被引入至蛋白质中［11］，这些氨基酸携带许多特殊功能基团，为蛋白质活性与结构的研究提供了广阔平台。

2 遗传密码扩充技术的应用

经由以上筛选机制得到的正交氨酰tRNA合成酶/tRNA系统已经将约70种的UAA特异性的引入至蛋白质中，这些UAA因其拥有广泛的性质被形象的称为“化学工具箱”，可以帮助我们深入研究蛋白质的结构与功能，以及赋予蛋白质更多更新更好的功能。

2.1 UAA引入用于蛋白质定点修饰

目前在蛋白质中天然氨基酸残基上的修饰往往会形成多修饰产物，在体内引入一些含有特殊侧链的UAA则可以通过与特定修饰剂的特异性反应而实现定点修饰。炔基与叠氮基团可以经由［3+2］环加成反应而形成三唑化合物，在蛋白质中定点引入含有二者之一的UAA可实现在此位点上被含有另一种基团的修饰剂所修饰。在肌红蛋白的第四位引入对炔丙氧基苯丙氨酸后，在以Cu2+离子做催化剂的碱性(pH 8.0)条件下和相应含叠氮基的修饰剂反应，可以使蛋白在特定位点分别带上单酰基和荧光基团，这两个基团分别在360和450 nm波长的紫外光照射下发光，起到标签的作用［12－13］。

酮基是有机化学中一类重要的功能性基团，而生物体内编码的天然氨基酸却没有包含酮基，在蛋白质中定点引入含酮基的UAA，可以有效突破一些天然蛋白质合成带来的限制。酮基在水溶液中、温和条件下可以与酰肼、羟胺和氨基脲反应分别生成相应基团，将对乙酰基苯丙氨酸定点引入Z－domain蛋白后，分别用荧光素酰肼和生物素酰肼对其进行反应，带有荧光素的蛋白在490 nm波长下显出荧光，而带有生物素的蛋白质经Western blot检测出条带［14］。酮基的定点修饰还可以用于测定分子间距离以分析蛋白结构，在T4溶菌酶的第72位引入对乙酰苯丙氨酸，并将其第157位突变为半胱氨酸，分别用两种修饰剂Alexa488－烷氧基胺和Alexa594－马来酰亚胺与上述两个基团进行反应形成蛋白的双标记，再运用单分子荧光共振能量转移技术测定供体和受体的分子距离，测定结果为34Å，与理论值一致［15］。我们可以利用温和方便的反应条件在酮基上尝试更多的修饰剂比如多糖、脂肪酸、寡核苷酸、多肽等，现在已经利用此反应对一些药用蛋白进行PEG修饰，PEG酰肼修饰的含对乙酰苯丙氨酸的人生长激素显示了增强的药理学功能，其研究已经进入了临床阶段。

由于硼酸在水溶液中生理pH值条件下可以与多羟基化合物发生可逆反应，而且比如硼酸盐和山梨醇以及葡萄糖胺的相互作用具有高亲和性，所以可以利用这个特点进行蛋白质的纯化。将Z－domain蛋白的第7位酪氨酸突变为TAG后定点引入对二羟硼基苯丙氨酸，再在室温，pH 8.5的条件下与N－甲基葡萄糖胺树脂结合，用高盐洗脱杂蛋白后再用过量山梨醇洗脱可以得到纯度很高的目的蛋白质(甚至高于镍亲和柱纯化的产物)，而二羟硼基具有可逆性的氧化还原反应，使超过95%的蛋白最终恢复为天然蛋白质(对二羟硼基苯丙氨酸经氧化反应可变为酪氨酸)。此类修饰可用于蛋白质的高纯度“无痕”纯化［16］。

2.2 UAA引入作为蛋白质探针

一些具有光化学活性的UAA可被用作探针在体外和体内的蛋白质功能研究中发挥作用:

将蛋白质“光笼”化可以实现用光来调节蛋白质的活性。这种“光笼”化的蛋白质是一种被“光笼”基团修饰的蛋白质，引入了“光笼”基团后蛋白质的活性通常会减弱甚至丧失，而脱“光笼”化后能够恢复蛋白质的活性。“光笼”基团易于除去，在365 nm波长光照下即可脱“光笼”化，这样通过光解反应可调节蛋白质在活性和非活性形式之间转变。最常用的“光笼”基团包括偶氮苯基和硝基苄基，它们可以和羟基、羧基、巯基反应，因此半胱氨酸、丝氨酸、赖氨酸、色氨酸都可以通过化学合成带上“光笼”基团。许多生物活性过程都可以因“光笼”化及脱“光笼”化带来的酶或受体的活性改变，离子通道的变化，胞内各种信号分子浓度的调节而得到瞬时瞬间的调控。通过一套改造了的Mj TyrRS/Mj tR－系统，可以实现在大肠杆菌体内将β－半乳糖苷酶的活性位点第503位酪氨酸替换为邻硝基苄酪氨酸。通过分别在体内和体外对β－半乳糖苷酶突变体的活性进行测定，结果证明了在活细胞体内以及体外都可对酶进行“光笼”化及脱“光笼”化，且对酶活性影响显著，作用稳定［17］。

利用特殊基团光致异构化的性质可以实现体内和体外监测一系列生物学过程。偶氮苯具有可转化的顺式和反式两种光学异构体，并且这两种异构体可经光致异构化，即当以320～340 nm波长光照射时，热力学稳定的反式异构体转变为顺式异构体，当大于420 nm波长光照射时顺式回复成为反式。由于这两种异构体的空间构象和偶极性不同，导致了含有不同异构体的蛋白质活性有差别。在大肠杆菌中将偶氮苯苯丙氨酸引入到分解代谢物基因激活蛋白CAP中，通过镍柱纯化得到突变CAP，产量可达1.5 mg/L。通过紫外－可见光谱测定蛋白质的吸收峰，并经光致异构化后测定蛋白质吸收峰的波长改变，结果验证了偶氮苯苯丙氨酸的高保真引入及可逆光致异构化成功发生。偶氮苯化的CAP由于其顺式和反式活性的差别，造成了与DNA亲和能力的差别，从而调节了转录过程［18］。

含有光致交联性质基团的氨基酸可用于配体－受体相互作用的研究。例如对苯甲酰苯丙氨酸，经350～365 nm波长光照射30 min激发后，其上的苯甲酮基团能与附近的C－H共价反应。在中国仓鼠卵细胞中，设计了一对正交分子对，其中的氨酰tRNA合成酶是Ec TyrRS的突变体，抑制型tRNA是嗜热脂肪芽孢杆菌来源的tRNATyr。将对苯甲酰苯丙氨酸引入到生长因子受体连接蛋白－2的受体结合口袋处的SH2区域。引入了pBpa的Grb2蛋白突变体在365 nm波长光照射下可与表皮生长因子交联，也可与内源性蛋白重组人酪氨酸激酶ErbB2发生交联反应，从而实现在哺乳动物细胞内研究蛋白质－蛋白质相互作用［19］。

2.3 UAA引入用于蛋白质结构研究

具有特殊谱学性质的UAA可以帮助我们更好的研究蛋白质的结构。比如在体内将同位素标记的UAA引入大分子蛋白质中可以有效地减小其核磁共振谱的复杂性。在人脂肪酸合酶硫酯酶区域活性位点附近的11个位点上分别引入三氟氧苯丙氨酸，13C－和15N－标记的对甲氧基苯丙氨酸，和15N－标记的间硝基酪氨酸，再分别经过1H－15N HSQC，1H－13C HSQC，和19FNMR测定不同的单个位点突变造成的化学位移，可以用于确定配体的结合位点以及配体结合在这些位点上形成的构象改变［20］。

除了被用于定点修饰，叠氮基团还是一种应用广泛的光致交联剂，在红外光谱上叠氮基团会在大约2 100 cm－1位置出现一个明显的伸缩振动峰，利用这一性质，先在G蛋白偶联受体视紫质中定点引入对叠氮基苯丙氨酸，再将其表达并重构进脂膜内，通过傅里叶转换红外光谱检测在光介导受体激活作用下叠氮基团伸缩频率的改变，可以揭示特定氨基酸对蛋白自身环境改变的影响［21］。

利用遗传密码扩充技术将核糖核苷酸还原酶的α2亚基的第730位和731位酪氨酸分别替换成3－氨基酪氨酸NH2Y，得到的突 变 体 Y730NH2Y－α2 和 Y731NH2Y－α2 在RNRβ2亚基、CDP和ATP存在的条件下经紫外－可见光谱和电子顺磁共振光谱检测，其结果解释了RNR的两个亚基结合时电子转移的机制［22］。

将含有环境敏感荧光基团的UAA引入蛋白质中有利于我们在体内和体外对蛋白质的结构和功能进行研究。比如在肌红蛋白中定点引入羟基香豆素衍生物可以作为检测蛋白质本地展开的探针［23］;将氟硅酸钠衍生物引入谷氨酸结合蛋白可以用于检测蛋白与配体结合后带来的结构改变［24］。

2.4 翻译后修饰的UAA的引入

许多翻译后修饰的氨基酸，例如磷酸化、磺化、甲基化、乙酰化、羟基化、硝基化的氨基酸可被定点引入到蛋白质中，从而改变蛋白质的生物学活性，改变多肽链的骨架进而影响蛋白质的稳定性。在大肠杆菌中用改造了的Mj TyrRS/tRNA对将对羧甲基－L苯丙氨酸pCMF引入到人信号转导及转录激活因子－1 STAT1中，pCMF是磷酸酪氨酸pTyr的类似物。STAT1蛋白质上第701位Tyr的磷酸化可以导致STAT1与DNA的紧密结合从而发挥其生物学活性，通过测定pCMF突变体与DNA的结合能力，结果显示引入了pCMF的STAT1突变体与天然磷酸化的蛋白质具有相同的DNA亲和力。pCMF的引入可以赋予蛋白质抵抗酪氨酸磷酸酶水解的能力，从而提高蛋白质的稳定性。通过这种方法实现了在原核生物体内无法完成的磷酸化等翻译后修饰，为制备信号转导通路中一系列磷蛋白的稳定体提供了可能性［25］。

在大肠杆菌中表达了将第9位赖氨酸取代为苯基硒代半胱氨酸PhSeCys的爪蟾组蛋白H3，接着将PhSeCys通过迈克尔加成反应生成乙酰基赖氨酸和甲基赖氨酸，从而实现了组蛋白的赖氨酸甲基化和乙酰化修饰，这为研究赖氨酸调控的组蛋白的生物化学机制打下了基础［26］。

2.5 在治疗性蛋白质中引入UAA

由于需要大量的同源修饰的蛋白质分子用于治疗目的，科学家们也已经开始尝试将遗传密码扩充技术应用于治疗性蛋白的研究中。目前这类研究有三个热点方向:其一是利用具有有免疫原性的氨基酸来阻断免疫耐受并生成可用于治疗癌症和炎症的疫苗，将对硝基苯丙氨酸引至目的蛋白的抗原表位可以延长其寿命，并产生可以与天然蛋白质有交联作用的抗体。比如将小鼠TNF－α的第11或86位氨基酸替换成对硝基苯丙氨酸所形成的新抗体可以与小鼠体内天然的TNF－α产生交联作用从而防止脂多糖介导的死亡的发生［27－28］。在T细胞的抗原表位引入对硝基苯丙氨酸可以激活B细胞自身反应生成与自身蛋白对应的多抗，这一原理可以应用在许多需要强免疫应答的抗原和抗原表位上。此类方法正在被应用在其他自身抗原上，比如与癌症相关的EGF及其受体HER2，与心血管疾病相关的前蛋白转化酶枯草溶菌素PCSK9，与炎症相关的过敏霉素C5a，以及人免疫缺陷病毒HIV的保守抗原表位和普通疫苗难以定位的疟疾等。

其次是生成抗凝血蛋白磺基水蛭素，水蛭素是临床应用最有效的天然抗凝血剂，然而由于机体内缺乏必需的硫基转移酶，在大肠杆菌和酵母体内重组表达的水蛭素都是非磺化。研究表明将第63位酪氨酸磺化后的水蛭素与人凝血酶的亲和力比非磺化水蛭素增加了10倍，磺化水蛭素比其非磺化形式显示出更好地临床应用前景［29］。

第三个方向是得到一系列蛋白轭合物，使它们的特定位点含有如毒素、放射性同位素、聚乙二醇、甚至另一种蛋白质(以实现双治疗功能)。要实现这一目的就要定点引入一个包含UAA的生物正交反应功能基团，这个基团随后在体外被其他小分子或大分子官能化，这一方法可以有效克服常规亲电子试剂的非特异性标记和半胱氨酸残基标记的非特异性或残基参与蛋白折叠的困难。在非治疗性蛋白的研究中，这个方法被普遍应用于多糖和脂类连接［13，30］，用荧光基团标记 G 蛋白偶联受体［31］，非天然组蛋白修饰［32］，和蛋白质的无痕纯化［16］。在治疗性蛋白的研究中，这个方法在生成具有特定药理学活性和毒性的同源治疗剂方面应用前景很广泛。而且由于UAA是在蛋白质翻译过程中被同时引入的，具有很高的效率，可以直接生成临床用量的标记蛋白。实际上在大肠杆菌系统中含有UAA的治疗性蛋白在1 000 L以上的高密度发酵情况下产量可以达到克每升级。例如含有对乙酰基苯丙氨酸的人生长激素hGH在的定点PEG修饰产物已经商业化生产出了数千克的量［33］，修饰后的hGH在保持生物活性的前提下其血浆半衰期大大延长。

3 展望

当下对于遗传密码扩充技术的研究重点包括对探索新的正交aaRS/tRNA分子对、编码更多的UAA、把正交系统应用于其他单细胞和多细胞生物体中等。编码结构更复杂的UAA需要不同的正交分子对、基于结构的活性位点文库以及更复杂的筛选方法，包括阶梯式筛选氨酰tRNA合成酶［34］。接下来这项技术将被扩展应用于其他真核细胞如杆状线和小鼠中。新的正交aaRS/tRNA分子对的发展还可应用于体内合成含有非天然骨架的生物多聚体如β－多肽。

遗传密码扩充技术将进一步用于在体内进化并筛选含有UAA的多肽、蛋白质或整个有机体的研究。将UAA引入到治疗性蛋白质中，如双特异性抗体，免疫毒素和疫苗将对医药发展产生重要影响。

［1］Bock A，Forchhammer K，Heider J，et al.Selenocysteine:the 21st amino acid［J］.Mol Microbiol，1991，5(3):515－520.

［2］Srinivasan G，James C M，Krzycki J A，Pyrrolysine encoded by UAG in archaea:charging of a UAG－decoding specialized tRNA［J］.Science，2002，296(5572):1459－1462.

［3］Kent SB.Chemical synthesis of peptides and proteins［J］.Annu Rev Biochem，1988，57:957－989.

［4］Evans Jr T C，Xu M Q.Intein－mediated protein ligation:harnessing nature's escape artists［J］.Biopolymers，1999，51(5):333－342.

［5］Giriat I，Muir T W.Protein semi－synthesis in living cells［J］.JAm Chem Soc，2003，125(24):7180－7181.

［6］Wang L，Schultz P G.Expanding the genetic code［J］.Angew Chem Int Ed，2005，44:34－66.

［7］Hamano－Takaku F，Iwama T，Saito－Yano S，et al.A mutant Escherichia coli tyrosyl－tRNA synthetase utilizes the unnatural amino acid azatyrosine more efficiently than tyrosine［J］.J Biol Chem，2000，275:40324－40328.

［8］Wang L，Brock A，Herberich B，et al.Expanding the genetic code of Escherichia coli［J］.Science，2001，292(5516):498－500.

［9］Chin JW，Cropp T A，Anderson JC，et al.An expanded eukaryotic genetic code［J］.Science，2003，301(5635):964－967.

［10］ Chen PR，Groff D，Guo J，et al.A facile system for encoding unnatural amino acids in mammalian cells［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2009，48(22):4052－4055.

［11］ Young T S，Schultz PG.Beyond the canonical 20 amino acids:expanding the genetic lexicon［J］.J Biol Chem，2010，285:11039－11044.

［12］ Chin JW，Santoro S W，Martin A B，et al.Addition of p－azido－L－phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli［J］.J Am Chem Soc，2002，124(31):9026－9027.

［13］ Deiters A，Schultz P G.In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli［J］.Bioorg Med Chem Lett，2005，15(5):1521－1524.

［14］ Wang L，Zhang Z，Brock A，et al.Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(1):56－61.

［15］ Brustad E M，Lemke E A，Schultz P G，et al.A general and efficient method for the site－specific dual－labeling of proteins for single molecule FRET［J］.J Am Chem Soc，2008，130(52):17664－17665.

［16］ Brustad E，Bushey M L，Lee JW，et al.A genetically encoded boronate－containing amino acid［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2008，47(43):8220－8223.

［17］ Deiters A，Groff D，Ryu Y，et al.A genetically encoded photocaged tyrosine［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2006，45(17):2728－2731.

［18］ Bose M，Groff D，Xie J，et al.The incorporation of a photoisomerizable amino acid intoproteins in E.coli［J］.JAm Chem Soc，2006，128(2):388－389.

［19］ Hino N，Okazaki Y，Kobayashi T，et al.Protein photo－cross－linking in mammalian cells by site－specific incorporation of a photoreactive amino acid［J］.Nat Methods，2005，2:201－206.

［20］ Cellitti SE，Jones D H，Lagpacan L，et al.In vivo incorporation of unnatural amino acids to probe structure，dynamics and ligand binding in a large protein by nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.J Am Chem Soc，2008，130(29):9268－9281.

［21］ Ye S，Huber T，Vogel R，et al.FTIR analysis of GPCR activation using azido probes［J］.Nat Chem Biol，2009，5:397－399.

［22］ Seyedsayamdost M R，Xie J，Chan CT，et al.Site－specific insertion of 3－aminotyrosine into subunitα2 of E.coli ribonucleotide reductase:direct evidence for involvement of Y730 and Y731 in radical propagation［J］.J Am Chem Soc，2007，129(48):15060－15071.

［23］ Wang L，Xie J，Schultz P G.Expanding the genetic code［J］.JAm Chem Soc，2006，128:8738－8739.

［24］ Lee H S，Guo J，Lemke E A，et al.The genetic incorporation of a small，environmentally sensitive，fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae［J］.J Am Chem Soc，2009，131(36):12921－12923.

［25］ Xie J，Supekova L，Schultz PG.A genetically encoded metabolically stable analogue of phosphotyrosine in E.coli［J］.ACSChem Biol，2007，2(7):474－478.

［26］ Guo J，Wang J，Lee JS，et al.Site－specific incorporation of methyland acetyl－Lysine analogues into recombinant proteins［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2008，47(34):6399－6401.

［27］ Grunewald J，Tsao M L，Perera R，et al.Immunochemical termination of self－tolerance［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(32):11276－11280.

［28］ Grunewald J，Hunt G S，Dong L，et al.Mechanistic studies of the immunochemical termination of self－tolerance with unnatural amino acids［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(11):4337－4342.

［29］ Liu CC，Schultz PG.Recombinant expression of selectively sulfated proteins in E.coli［J］.Nat Biotechnol，2006，24(11):1436－1440.

［30］ Liu H，Wang L，Brock A，et al.A method for the generation of glycoprotein mimetics［J］.JAm Chem Soc，2003，125:1702－1703.

［31］ Ye S，Kohrer C，Huber T，et al.Site－specific incorporation of keto amino acids into functional G protein－coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesi［J］.J Biol Chem，2008，283:1525－1533.

［32］ Guo J，Wang J，Lee JS，et al.Site－specific incorporation of methyland acetyl－lysine analogues into recombinant proteins［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2008，47:6399－6401.

［33］ Deiters A，CroppT A，Summerer D，et al.Site－specific PEGylation of proteins containing unnatural amino acids［J］.Bioorg Med Chem Lett，2004，14(18):5743－5745.

［34］ Xie J，Liu W，Schultz P G.A genetically encoded bidentate metalbinding amino acid［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2007，46(48):9239－9242.

Application trends of expanding genetic codes in protein researches

LIU Ya－guang，FANG Zheng－zhi，YAO Wen－bing
(School of Life and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Q51

A

1005－1678(2011)04－0328－04

2010－10－25

博士点基金(20090096110006)和“青蓝工程”资助

刘亚光，男，硕士研究生;姚文兵，通信作者，教授，博士生导师，Tel:025－83271218，E－mail:wbyao@cpu.edu.cn。