阳离子铝酞菁红区荧光探针测定硫酸软骨素

尹 璐，王 敬，黄 萍，邓雅斌，李东辉

(厦门大学 医学院 抗癌研究中心，福建 厦门 361005)

阳离子铝酞菁红区荧光探针测定硫酸软骨素

尹 璐，王 敬，黄 萍，邓雅斌，李东辉

(厦门大学 医学院 抗癌研究中心，福建 厦门 361005)

目的 建立以阳离子铝酞菁为红区荧光探针定量测定硫酸软骨素(CS)的新方法。方法 在pH 5.0的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中，阳离子铝酞菁与CS发生相互作用形成离子缔合物而导致荧光猝灭。在610 nm波长光的激发下，随着CS的加入，探针的特征发射峰(676 nm)处的荧光强度逐步减弱。结果 在最佳条件下，荧光强度差值(ΔIf)与CS浓度(C，μg/mL)在0.2～1.3μg/mL内呈良好的线性关系，工作曲线为 ΔIf=406.67 C－36.23，r=0.997。建立了溶剂沉淀法成功地进行了样品的前处理，实现了实际样品(滴眼液)的准确测定。结论该法简便、快速、抗金属离子及小分子干扰的能力较强，可用于复杂实际样品中CS的含量测定。

硫酸软骨素;荧光分光光度法;酞菁;红区荧光探针;含量测定

硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是从动物软骨中提取的酸性黏多糖。临床上用作骨关节炎和类风湿性关节炎的防治药物，具有抗凝血、抗肿瘤、抗关节炎等生理活性，在医学材料、保健品等领域的应用越来越引起人们的重视［1］。对冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病、骨关节炎等也有一定的疗效［2-3］。CS常见的测定方法有高效液相色谱法［4］、比色法［5］、AHMT 分光光度法［6］、离子色谱法［7］、分光光度法［8］、高效毛细管电泳法［9］等。但上述方法尚存在一些不足之处，如对仪器和试剂要求较高，操作较为繁琐，精密度、准确度、抗干扰能力较低等。四取代三甲基碘化铵金属酞菁是一类阳离子染料，如中心配位元素为反磁性原子，则化合物具有红区发射的荧光特性，可有效避开背景荧光和散射光的干扰，且光漂白作用小。酸性条件下，此类化合物带正电荷，易与带阴离子基团的生物大分子发生静电作用而形成离子缔合物。本文利用该类化合物的上述特点，以四取代三甲基碘化铵铝酞菁［Tetra(trimethylammionio)aluminum phthalocynine，TTMAAlPc］为红区荧光探针，在酸性介质中与CS发生结合反应，导致体系荧光强度降低，建立了CS荧光定量分析新方法。

1 材料

TTMAAlPc按文献［10］方法合成并纯化，配制1.0×10－3g/mL 储备液。

CS(纯度95%)，Sigma公司;复方CS滴眼液，山东博士伦福瑞达制药有限公司;其他试剂均为分析纯，实验用水为高纯水。

LS-55荧光分光光度计，美国PerkinElmer公司;sbs型pH计，美国奥立龙公司;Spectra Max M5-多功能酶标仪，美国 Molecular Devices公司。

2 方法与结果

2.1 测定方法

0.2 mol/L Britton-Robinson(B-R)系列缓冲液:在浓度均为0.04 mol/L的磷酸、乙酸、硼酸混合液100 mL中加入一定体积的0.2 mol/L NaOH溶液，即得相应pH值缓冲液。

1.0 mg/mL CS储备液，4℃冰箱保存，工作液即用即配。

在5 mL比色管中依次加入适量水、1.0×10－4g/mL TTMAAlPc溶液、1/10体积 pH 5.0的 B-R缓冲液、一定量的CS溶液，用水稀释至刻度，摇匀后于室温下静置反应10 min。以试剂空白为参比，用3 mL样品池在676 nm波长处测量不同浓度CS的荧光强度。试剂空白记为If0，含有CS的记为If，荧光强度差 ΔIf=If0－If。

2.2 阳离子酞菁的分子结构和光谱特性

TTMAAlPc(图1)是一种具有类似卟啉结构的强荧光化合物，由于其外周的四个苯环上各有一强极性的阳离子基团，因而在水中的溶解度较大，便于实际应用。TTMAAlPc的荧光发射峰(676 nm)处于红区(图2)，其激发带有两个，一个位于紫外区称Soret带;另一个位于长波处，称Q带。如采用短波激发，将在其倍频处产生很强的二级散射(散射峰在700 nm左右)，故为避开此二级散射的干扰，激发波长选择在长波处(610 nm)。加入CS后，TTMAAlPc的荧光发生猝灭，但峰位置并未改变。阳离子金属酞菁易于与带有阴离子的生物大分子形成离子缔合物而发生减色效应与荧光猝灭现象［11］。CS的分子骨架上带有酸性基团-COOH和-SO3H，在弱酸性介质中，TTMAAlPc与荷负电的CS发生相互作用而聚集，导致荧光猝灭，本文的方法即是据此荧光猝灭现象而建立。

图3为TTMAAlPc与CS复合物在激发波长为610 nm，在650～750 nm范围内的荧光发射光谱图。在pH 5.0的B-R缓冲液中，阳离子酞菁在676 nm左右有最大发射波长(图3曲线1)。加入CS后发生荧光猝灭，猝灭程度随CS加入量增大而增大(图3曲线2～9)。

图1 TTMAAlPc的分子结构Fig.1 Molecular structure of Tetra(trimethylammionio)aluminum phthalocynine(TTMAAlPc)

图3 荧光发射光谱图Fig.3 Fluorescence emission spectra of TTMAAlPc in the presence of different concentrations of CS

图2 TTMAAlPc的激发和发射波谱图Fig.2 Emission and excitation spectra of TTMAAlPc

2.3 酸度的影响

在pH 2.2～12.0的范围内，考察了体系pH对荧光强度变化的影响(图4)。1.0×10－6g/mL TTMAAlPc加不同pH值B-R缓冲溶液加浓度为1.0 μg/mL的CS溶液，溶液总体积5 mL。可以看出，当pH 5.0时 ΔIf值达到最大，故本文选用 pH 5.0的B-R缓冲溶液，缓冲液用量为反应总体积的1/10。

图4 pH值对荧光猝灭程度的影响Fig.4 Influence of pH on the degree of fluorescence by CS

2.4 反应时间、温度和体系的稳定性

考察了反应时间和温度对结合反应的影响，发现该反应的速度较快，室温下10 min即可达到平衡，且体系具有较好的稳定性，荧光强度值在0.5 h内维持恒定。

2.5 荧光探针用量的影响

建立了不同 TTMAAlPc探针浓度(0.5 ×10－6，1.0 ×10－6，2.0 ×10－6，3.0 ×10－6g/mL)下的工作曲线。各浓度线性范围依次为 0.08～0.8，0.2～1.3，0.6 ～ 2.0，1.5 ～ 6.0 μg/mL。结果表明，TTMAAlPc浓度为1.0×10－6g/mL时，工作曲线线性区间最大，灵敏度亦较好，故选择TTMAAlPc的最适浓度为1.0 ×10－6g/mL。

2.6 工作曲线

在优化条件下，以CS浓度(C，μg/mL)对ΔIf绘工作曲线，得线性回归方程为 ΔIf=406.68 C－36.24，r=0.997，线性范围 0.2 ～ 1.3 μg/mL，检测限(3σ)为0.021 μg/mL。

2.7 共存物质的影响

分别考察了常见金属离子、氨基酸等物质对体系的干扰(表1)。可以看出，上述物质的存在对体系测定的影响不大，其相对误差在±5.0%范围内。干扰实验结果表明，本法对上述物质的抗干扰能力要优于文献报道。DNA、蛋白质等生物大分子和表面活性剂的对结果干扰较大，这可能是由于它们参与对TTMAAlPc的竞争结合所致。

2.8 实际样品的测定

表1 常见干扰物对CS测定的影响(CS=1.0μg/mL)Tab.1 Influence of coexisting substances on the determination of CS(CS=1.0 μg/mL)

2.8.1 回收率试验 精密吸取已知浓度的滴眼液溶液20μL，9份，置于9个10 mL量瓶中，分别加入0.1 mg/mL CS对照品溶液20，40和60μL各3份，加水稀释至刻度，按2.1项下方法测定含量，并计算回收率，结果分别为 105.1%，100.0%，110.5%，107.1%，107.1%，108.0%，107.3%，107.8% 和106.2%，平均回收率为 106.6%，RSD 为 2.69%(n=9)。

2.8.2 样品测定 精密吸取CS滴眼液1 mL，加入丙酮2 mL，并用5 mol/L NaOH溶液2μL调节pH，摇匀，至沉淀不再增加，离心，取上清液，按2.1项下方法测定。

测得滴眼液 CS含量为0.14μg/mL，RSD为1.21%(n=9)。

3 讨论

本文建立了一种CS荧光定量分析新方法，具有准确、快速、方便的特点。采用的荧光探针TTMAAlPc是一种阳离子酞菁化合物，水溶性好、量子产率高。其荧光发射位于长波(红区)波段，由于在此区域能发荧光的天然或合成的物质极少，且由于散射光与波长的四次方成反比，因而，使用TTMAAl-Pc作为分子探针十分有利于避开试样背景荧光及散射光的干扰，从而提高测定的灵敏度和准确度。此外，由于可采用长波(610 nm)激发，光漂白作用小，有利于体系荧光的稳定。

实际样品的测定是本文拟解决的重点问题，本文选择滴眼液为受试样品，其主要成分为CS、维生素E、维生素B6、尿囊素、牛磺酸，另有辅料玻璃酸钠、硼酸、硼砂、冰片、薄荷脑、乙醇、吐温80、三氯叔丁醇等。尤其是其所含的玻璃酸与CS同属黏多糖，结构具有相似性，实验表明其对CS的测定存在较为明显的干扰，因此需对样品进行前处理以消除干扰。文献推荐的分离二者的方法有:溶剂分级沉淀、季铵盐表面活性剂沉淀、离子交换色谱、凝胶色谱、超滤、电泳［11］。本文采用溶剂分级沉淀法，这是因为溶剂沉淀法与季铵盐沉淀较为简便，但季铵盐对本法有一定干扰，而其余方法步骤较多，不利于实际应用。我们采用丙酮沉淀，并用NaOH溶液调节pH，成功地实现了玻璃酸与CS的沉淀分离，离心后取上清即可进行测定。操作简便、快速，具有较好的实用性，测定结果令人满意。

［1］卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准(二部)［S］.第六册.1998:138-139.

［2］刘 武.硫酸软骨素药理作用研究进展［J］.中国药业，2008，17(8):64-66.

［3］陈 磊，凌沛学，张天民.硫酸软骨素在骨关节炎防治中的作用［J］.中国生化药物杂志，2008，29(2):137-139.

［4］Wayne K W，Kathleen G G，Andrew G B.Determination of chondroitin sufate in nutritional supplements by liquid chromatography＆ Related Technologies［J］.J Liq Chrom Rel Technol，2000，23(18):2851-2860.

［5］董 明，曾正宏，陈桂阳.比色法测定复方硫酸软骨素片中硫酸软骨素含量［J］.中国生化药物杂志，2002，23(4):191-192.

［6］Kunihiro K，Misako T，Kiyoshi T，et al.Spectrophotometric determination of sodium chondroitin sulfate in eye drops after derivatization with 4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1，2，4-triazole［J］.Analyst，1995，120:2755-2758.

［7］茅 力.离子色谱法测定硫酸软骨素的含量［J］.中国药科大学学报，1998，29(5):358-361.

［8］高贵珍，焦庆才，丁一磊.天青A分光光度法测定硫酸软骨素含量的研究［J］.光谱学与光谱分析，2003，23(3):600-602.

［9］沈剑如，陈振德，于荣敏.高效毛细管电泳法测定硫酸软骨素含量［J］.中国生化药物杂志，2010，31(3):197-199.

［10］ Duan W B，Wang Z X，Cook M J.Synthesis of tetra(trimethylammonio)phthalocyanato zinc tetraiodide，［ZnPc(NMe3)4］I4，and a spectrometric investigation of its interaction with calf thymus DNA［J］.Porphyrin Phthalocyanies，2009，13:1255-1261.

［11］ 凌沛学，张天民.透明质酸［M］.北京:中国轻工业出版社，2002:5-8.

Fluorimetric determination of chondroitin sulfate with cationic aluminum phthalocyanine used as a fluorescent probe emitting at red-region

YIN Lu，WANG Jin，HUANG Ping，DENG Ya-bin，LI Dong-hui
(Cancer Research Center，School of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361005，China)

Purpose To propose a novel method for quantitative determination of chondroitin sulfate(CS)in practical samples using cationic aluminum phthalocyanine as a fluorescence probe emitting at red-region.Methods It was found that the fluorescence of［Tetra(trimethylammionio)aluminum phthalocyaine］，a cationic red-region fluorescence probe，was extremely quenched by CSin acidic media，because of the formation of association complex between TTMAAlPc and CS.Based on this phenomenon，a new method was developed for quantitative determination of CS.Results Under the optimal conditions(pH 5.0，a reaction time of 10 min，and at room temperature)，the linear range of assay was 0.2-1.3 μg/mL and the detection limit was 0.021 μg/mL.Establishing a solvent precipitation method for sample pre-treatment successfully，we achieve the accurate determination of actual sample(eye drops).Conclu-sion The constructed method is not only accurate but also reliable.It has been used to the analysis of practical samples(eyes-drops)with satisfied results，exhibiting the great potential for practical applications.

chondroitin sulfate;fluorospectrophotometry;phthalocyanine;red-region fluorescence probe;assay

O657.3;R927.3

A

1005-1678(2011)04-0277-04

2011-04-06

国家自然科学基金(No.90206016，20015005)和福建省公益类科研院所基本科研专项(No.2010R1101)

尹 璐，女，硕士研究生，从事生化分析研究;李东辉，通信作者，Emai:Lidh@xmu.edu.cn。