SOX10蛋白在先天性巨结肠肠壁中的表达

吴小红

(江苏大学附属宜兴医院胃肠外科,江苏宜兴,214200)

先天性巨结肠病(HD)是小儿外科常见的消化道畸形,主要病理改变是在狭窄的肠管黏膜下和肠肌层神经丛的神经节细胞完全消失,通常伴有黏膜肌层肥大以及黏膜下和固有肌层肌间神经数目和体积增加,其病因目前尚无定论。最近,研究人员发现了SOX10基因突变及表达异常与先天性巨结肠的发生有一定的关系,并且有关出生后组织中SOX10的细胞分布及表达已有报道[1],国内此类研究目前还较少。本文运用Western blot技术检测SOX10蛋白在散发性HD肠壁中的表达,进一步了解HD在分子基础上的发病机制,为临床提供参考。

1 材料和方法

1.1 临床资料

实验组:收集本院2004年11月～2009年10月手术切除的经病理诊断为HD的病变段结肠标本16例,分别取狭窄段、移行段、扩张段全层肠壁组织,用无菌生理盐水冲洗表面污垢后,立即送-80℃恒温冰箱中保存。16例患儿中,男性10例,女性6例,年龄14天～14岁,中位年龄 6岁。新生儿2例;1个月至9岁13例;14岁1例。长段型3例;普通型5例;短段型8例。均为散发性,无家族史,无合并其他主要脏器的先天性畸形或综合征。

对照组:随机选取16例非巨结肠手术患儿,年龄6天～6岁,男8例,女8例。其中肛门直肠畸形5例(肛门闭锁2例、直肠闭锁3例),均行结肠造瘘术,肠套叠行肠吻合术8例,关瘘术3例。取造瘘口处肠壁,并经病检确认存在神经节细胞。

1.2 方法

采用Western blot法分析测定,根据Bradford法测定样本胞膜蛋白浓度后,取一定量的胞膜蛋白溶液,用5×电泳加样缓冲液将胞膜蛋白裂解液稀释成 5 μ g/μ L 的溶液 100 μ L,95 ℃水浴5 min后,-80 ℃保存备用。实验时,取 10 μ L的胞膜蛋白裂解溶液(含等量蛋白50 μ g)电泳转膜。10%牛血清封闭1 h后,加山羊抗人SOX10多克隆抗体一抗(美国Santa cruz公司,1:400),4℃孵育过夜。PBS冲洗膜3遍后,加驴抗山羊二抗(上海碧云天生物技术研究所,浓度为1:2000),室温孵育1 h后,PBS冲洗膜3遍,DAB显色试剂显色。Image J分析软件测定条带的灰度值,用GAPDH条带的灰度值作内对照进行校正,分别计算出各样本的相对表达量。

2 结 果

SOX10蛋白在HD患儿痉挛段表达减少,在移行段、扩张段、对照组的表达无明显变化(图1)。

痉挛段分别与移行段、扩张段、对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);移行段、扩张段、对照组之间相互比较,差异无统计学意义(P>0.05),见表1和图2。

图1 SOX10蛋白和GAPDH在痉挛段(A组)、移行

表1 SOX10蛋白在痉挛段、移行段、扩张段和对照组结肠肠壁的表达

图2 SOX10蛋白在痉挛段、移行段、扩张段和对照组结肠肠壁的表达

3 讨 论

HD主要病变为肠道末端一段肠壁的肠神经丛神经节细胞缺失,累及肠段持续异常收缩,其上段结肠仍然保持蠕动功能,结果导致代偿性扩张、肥厚,最终形成巨结肠,又称无神经节细胞症。诊断通常结合主要症状、结肠的放射学表现、直肠测压以及直肠活组织检测的组织学特征,典型的组织学特征包括神经节细胞缺失和粗大的神经干[2]。目前研究已表明,HD是一种多基因控制的疾病,一些基因的缺失或突变可导致微环境变化,引起肠神经母细胞(神经嵴胚细胞)迁移的停顿从而导致HD。文献报道先天性巨结肠的病因可能与原癌基因RET、血内皮素B受体基因(EDNRB)及其配基血管内皮素-3基因(EDN3)有关[3]。

SOX10基因是近来发现的一种与HD发病机制相关的转录调控因子,位于染色体 22q13,1[3]。SOX10编码一个转录因子,其在胚胎期的神经嵴细胞内有表达,这一现象出现在不同的神经嵴细胞(如肠神经元)从外胚层分离出来之前,此后,SOX10在细胞迁移过程中被转录。SOX10基因含一段高迁移率族:DNA结合蛋白的结构域。研究证实了瓦登布格综合征(WS4)患者中存在SOX10基因突变,提示SOX10基因对于早期神经嵴细胞系向黑色素细胞和肠神经节的分化起调控和信号转导作用。Southard等[4]研究发现,SOX10的未成熟终止突变可引起神经嵴衍生物表达缺失,证明在发生突变的胚胎中同时存在SOX10和EDNRB的异常表达及由于细胞凋亡而引起的神经嵴衍生物的缺失。提示SOX10对非常早期的多能神经嵴源性祖细胞的存活和发育是必需的。SOX10蛋白与其他转录因子或配体蛋白形成复合体调控基因的表达,如SOX10可调控RET基因的表达[5]。SOX10在神经嵴细胞分化为肠神经细胞、肠神经节的过程中起到调节和信号旁路的作用,其突变可导致伴发Shah-Waardenburg综合征型的HD。而Sham等[6]对不伴有其他症状的HD患者进行SOX10测定时,发现第5外显子1876位置处核苷酸碱基A被G代替,而且发现2例患者309密码处发生CAC-CAT沉默突变。

作者通过对SOX10蛋白在非HD患儿和非症状的HD患儿结肠中的表达研究发现,SOX10蛋白在正常对照组的每个样本都有表达,表明SOX10在胚胎发育之后的成熟肠神经系统有一定的作用。

[1] Pingault V,Bondurand N,Kuhlbrodt K,et al.SOX10 mutations in Patients with Waardenburg-HirschsPrung disease[J].Nat Genet,1998,18(2):171.

[2] Barshack I,Fridman E,Goldberg I,et al.T he loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung′s disease[J].J Clin Pathol,2004,57(7):712.

[3] Shimotake T,Tomiyama H,Aoi S,et al.Discrepancy between macroscopic and microscopic transitional zones in Hirschsprung′s disease with reference to the type of RET/GDNF/SOX10 gene mutation[J].J Pedi Surg,2003,38(5):698.

[4] Southard-Smith E M,Kos L,Pavan W J.Sox10 mutation disrupts neual crest development in Dom Hirschsprung mouse model[J].Nat Genet,1998,18(1):60.

[5] Lang D,Chen F,Milewski R,et al.Pax3 is required for enteric ganglia formation and functions with Sox10 to modulate expression of c-ret[J].J Clin Invest,2000,106(8):963.

[6] Sham M H,Liu V C,Fu M,et al.SOX10 isabnormally expresed in aganglionic bowel of Hirschsprung's disease in fants[J].Gut,2001,49(2):220.