依达拉奉对沙鼠前额叶切除后学习与记忆的影响

王贵振 范卫庆 曹刚仁 汤永洋 王 亮 史 强

山东新泰市人民医院神经外科 新泰 271200

依达拉奉对沙鼠前额叶切除后学习与记忆的影响

王贵振 范卫庆 曹刚仁 汤永洋 王 亮 史 强

山东新泰市人民医院神经外科 新泰 271200

目的探讨依达拉奉对沙鼠前额叶切除后学习记忆的影响及其机制。方法40只蒙古沙土鼠随机分为4组,假手术组、前额叶切除组、对照组、依达拉奉治疗组,每组10只。7 d后应用4-PTT(4-pellet taking test)旱路迷宫对各组沙鼠学习记忆功能进行评定。完成迷宫实验的沙鼠取脑组织行HE染色和胆碱能神经元免疫组化染色,观察海马CA1区神经元损伤程度,用锥体细胞密度评价,CHAT阳性胆碱能神经元细胞用真彩色图像分析系统定量和半定量分析。结果4-PTT旱路迷宫实验显示,前额叶切除组中沙鼠参照记忆指标和工作记忆指标与假手术组有明显的差异(P＜0.05),依达拉奉治疗组上述指标显著改善(P＜0.05)。假手术组未见坏死神经元,前额叶皮质切除组每个高倍视野中锥体细胞数和阳性胆碱能神经元数均少于假手术组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。依达拉奉治疗组每个高倍视野中锥体细胞数和阳性胆碱能神经元数均多于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论依达拉奉能改善前额叶切除沙鼠的学习记忆能力,与其对胆碱能神经元的保护有关。

前额叶;胆碱能神经元;4-PTT旱路迷宫;依达拉奉

依达拉奉可清除自由基,抑制脂质过氧化,从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤,在治疗缺血性脑血管病方面有一定疗效。但依达拉奉对脑损伤后引发的高级功能障碍是否具有改善作用尚需深入研究。本研究利用沙鼠的前额叶切除模型,用4-PTT(4-pellet taking test)旱路迷宫及组织学方法,从海马区神经元和胆碱能细胞的变化角度,来探讨依达拉奉对学习记忆的影响。

1 材料和方法

1.1 动物模型制备 参考文献[1]报道的方法制作前额叶皮质切除模型。在(22±1)℃环境温度下,将沙鼠予3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立体定向仪上。切开头皮,暴露颅骨,在冠状缝前 1.0 mm、矢状缝旁开2 mm处用显微磨钻钻一小骨窗,用显微持针器扩大骨窗。用自制吸引器吸除冠状缝前约1.0 mm至额极的右侧额叶背外侧皮质,作一 4 mm×3 mm×1mm大小的创腔,明胶海绵填塞止血后缝合头皮。各组动物在手术完成7 d或21 d后进行4-PTT旱路迷宫实验,测试学习记忆能力。

1.2 分组及给药方法 40只雄性蒙古沙土鼠(浙江省实验动物中心),体质量60～80 g,9～12周龄,随机分为：假手术组,前额叶切除组,对照组(与依达拉奉等量0.9%氯化钠溶液),依达拉奉治疗组,每组10只。依达拉奉组于脑缺血后即刻尾静脉注射依达拉奉0.5 mg/kg,1次/d,连续 7 d。对照组注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.3 脑组织形态结构观察 迷宫实验完成后动物取前囟后2.5～4.0mm之间的大脑部分进行常规脱水,石蜡包埋,切片行HE染色。海马神经元损伤的评价主要依据Kirino[2]等人的方法,在Olympus光镜下观察海马CA 1区锥体层细胞形态变化并计数单位高倍视野(400×)下的神经元数,即神经元密度(Neuronal density,ND)。我们在左右两侧海马各任取3个高倍视野(400×)记数,取平均值。

1.4 胆碱能神经元观察 石蜡切片,常规脱蜡至水。按试剂盒说明行CHA T免疫组化染色。在显微镜下计数两侧海马CA1区各3个高倍视野(400×)范围内的 CHA T阳性细胞并取平均值。

1.5 4-PTT旱路迷宫实验,测试沙鼠学习记忆能力 主要采用的检测指标为：(1)达到完成标准所需的实验次数;(2)每次完成实验所用的时间;(3)每次实验中从开始到吃掉第一个食丸所用的时间;(4)每次实验中的正确错误数。指标(1)、(2)、(3)主要观察动物通过训练后能正确完成实验的情况,反映动物参照记忆的形成,指标(4)主要观察动物进入无食物盒次数、重复进入已吃掉食物食盒次数,反映动物工作记忆的形成。

1.6 统计学处理 实验结果用均数±标准差表示,用SAS 8.20版统计软件包进行完全随机设计的方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 学习记忆测试结果 与假手术组比较,前额叶切除组中沙鼠TCTP、TCFP、TRCS、IE和 CE都有明显差异(P＜0.05);与前额叶切除组比较,对照组中上述指标无明显变化,而依达拉奉治疗组有较大的改善,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 病理结果(HE染色)假手术组 海马CA 1区神经元结构完整,排列整齐致密,未见变性坏死的神经元;缺血组与对照组海马CAI区神经元大部分变性坏死,细胞间隙加大,细胞核浓缩、深染,溶解、消失;依达拉奉治疗组海马CA1区存活的神经元较前额叶切除组明显增多,大部分为结构完整的神经元;4组神经元密度差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.3 CHAT免疫组织化学结果 显微镜观察发现假手术组沙鼠海马CA1区阳性胆碱能神经元结构完整,排列整齐致密,可见2～3层细胞,细胞核染色淡,核仁清晰,胞浆染成深棕色,未见明显变性坏死的神经元。前额叶切除组可见海马CA 1区阳性胆碱能神经元排列稀疏,胞浆染成浅棕色,可见变性坏死的神经元。见表2。

表1 各组工作记忆与参照记忆的比较

表2 各组海马CA 1区神经元密度与阳性胆碱能神经元的比较

3 讨论

本实验中,应用4-P1T旱路迷宫测试系统,全面、客观的对实验动物的空间认知、记忆加工过程进行评价,结果显示：前额叶切除后沙鼠的学习记忆能力明显受损,依达拉奉治疗组沙鼠参照记忆和工作记忆明显改善。依达拉奉通过多个途径减少自由基的产生,减轻自由基对组成细胞磷脂膜的多聚不饱和脂肪酸的氧化损伤,抑制出血后神经细胞凋亡和细胞(血管内皮细胞、神经细胞)的过氧化作用,从而减轻脑水肿和脑组织损伤[3-4]。因胆碱能神经元释放的乙酰胆碱在学习与记忆中有重要的调节作用,保持其功能正常,是维持哺乳动物学习记忆正常进行的必要条件[5]。

[1]吴佐泉,王溶杨,马廉亭,等.胎脑组织移植对额叶皮层损伤大鼠辨别学习、记忆之影响[J].中华器官移植杂志,1997,18(1)：42-44.

[2]Kirino T,Tamu ra A,Sano K.A reversible ty pe of neu ronal injury follow ing ischem ia in the gerbil hippocam pus[J].Stroke,1986,17：455

[3]Kozue S,Yuki OL Semi S,et al.Edaravone scavengers nitric oxide[J].Redox Report,2002,7(4)：219-222.

[4]陈吉相,季艳梅,孙圣刚,等.依达拉奉对脑出血大鼠细胞凋亡及Bc l-2、Bax蛋白表达的影响[J].华中科技大学学报(医学版),2007,36(2)：259-261.

[5]万选才,杨天祝,徐承焘.现代神经生物学[M].北京：北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社,1999：127.

Effect of Edaravone on learning-mem ory after prefrontal cortex excision in gerbils

Wang Guizhen,Fan Weiqing,Cao Gangren,etal.Departmentof Neurosurgery,X intaiPeop le's Hospital,X intai271200,China

ObjectiveTo investigate the effect and the possib le p rotectivemechanism of Edaravone on learning-memory function after p refrontal cortex(PFC)excision in gerbils.MethodsForty gerbils w ere random ly divided into sham-operated group,prefrontal cortex excision group,controlgroup,and Edaravone treatment group.The gerbils of allgroupsw ere carried out 4-PTT maze experiment on the seventh day after operating.After themaze experiment,the brain tissue of the gerbilsw as performed HE staining and immunohistochemical staining of CHAT-positive cholinergic neuron.The damaging degreeofnerve cells in hippocam pus CA1 region w as evaluated by neuronal density.CHAT-positive cho linergic neuron were detected by color image analysis system.Resu lts There were significant differences in the indexes of reference-memory and workingmemory betw een sham operation group and prefrontal cortex excision group.The indexes in Edaravone treatmentgroup w ere improved obviously(P＜0.05);No degenerated and necrotic neurons were found in sham operation group.The density of neurons in p refrontal cortex excision group w as significantly decreased,as compared with that in sham group(P＜0.05).The density of neurons in Edaravone was obviously increased,as compared with that in prefrontal cortex excision group(P＜0.05).The ND/HS,CHAT-positive cells/HS of PFC group w ere fewer than those of sham-operated group,and had statistical significance(P＜0.05);The ND/HS,CHAT-positive cells/HS of Edaravone treatment group weremore than those of controlgroup,and had statistical significance(P＜0.05).ConclusionEdaravone can imp rove the learning-memory function after prefrontal cortex excision in gerbils,because of its protection on cholinergic neurons.

PFC;Cholinergic neuron;4-pellet taking test;Edaravone

R-332

A

1673-5110(2011)07-0014-03

(收稿2011-01-18)