MMP-2、MMP-9基因多态性与缺血性脑卒中临床分型及预后

刘 丹 王亚春 孙洪英 连 瑜 贾 璐 吴丽娥 王贵喜 郭 霞

包头医学院第一附属医院神经内2科 包头 014010

MMP-2、MMP-9基因多态性与缺血性脑卒中临床分型及预后

刘 丹 王亚春 孙洪英 连 瑜 贾 璐 吴丽娥 王贵喜 郭 霞

包头医学院第一附属医院神经内2科 包头 014010

目的探讨基质金属蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)基因 C1306T、C735T和MM P-9基因C1562T多态性位点与缺血性脑卒中的关系。方法采用限制性片段长度多态性分析技术,检测缺血性脑卒中组232例和健康对照组235例MMP-2基因C1306T、C735T和MMP-9基因C1562T多态的分布。结果缺血性脑卒中组和对照组MMP-2 C1306T基因型和等位基因频率分布无统计学意义。在动脉粥样硬化性血栓性脑梗死组MM P-9 C1562T的CT+TT基因型频率和T等位基因频率、MMP-2 C735T的CC基因型频率和C等位基因频率明显高于对照组(P＜0.05),而在脑栓塞组、腔梗组差异无统计学意义(P＞0.05)。多因素Logistic回归分析,MM P-2、MMP-9不同基因型别与缺血性脑卒中预后无显著相关性(P＞0.05)。结论MMP-2 C735T的C等位基因、MM P-9 C1562T的T等位基因是动脉粥样硬化性血栓性脑梗死的遗传易感基因之一。MMP-2、MMP-9基因多态性与缺血性脑卒中预后无关。

基质金属蛋白酶-2、9基因多态性;缺血性脑卒中;临床分型;预后

MMP-2基因启动子区1306、735和 MMP-9基因启动子区1562位点存在C→T突变,从而影响 MMP-2、MMP-9的表达,影响脑卒中的发生发展。本文拟探讨 MMP-2、M MP-9基因多态性与缺血性脑卒中的关系。

1 资料与方法

1.1 对象和方法 选择2009-07～2010-10在我科连续住院的初发缺血性脑卒中患者,均符合全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准,并经头颅CT或M RI检查证实。缺血性脑卒中临床分型包括动脉粥样硬化性血栓性脑梗死、脑栓塞、腔隙性脑梗死。有严重感染、恶性肿瘤、结缔组织病以及1 a内患组织损伤疾病如心肌梗死、重大外科手术及接受免疫抑制剂治疗者除外。同期选择健康人群作为对照组。入组者均为包头市长住居民,均为汉族,彼此无亲缘关系。

1.2 基因型判定

1.2.1 标本采集及DNA的抽提：抽取患者晨空腹静脉血2 m L,置EDTA-Na2抗凝管中-20℃冰箱保存备用。使用北京天根公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR)：PCR引物序列参照文献设计,由上海生工合成。MMP-2 C1306T序列为：上游引物5′-CTTCCTAGGCTGGTCCTTACTGA-3′下 游 引 物 5′-CTGAGACCTG AAGACCTAAAGAGCT-3′, 扩 增 产 物 为193bp。MM P-2 C735T序列为：上游引物5′-GGAT TCTTGGCTTGGCGCAGGA-3′下游引物 5′-GGGGGCTGGGTAAAATGAGGCTG-3′,扩增产物为 391 bp;MM P-9 C1562 T序列为：上游引物 5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′下游引物 5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′,扩增产物 为435 bp。反应体系为 25μL,其中模板 DNA 100 ng,10×buffer 5μL,dDNPs 1μL,TaqDNA聚合酶 1.0 U和上下游引物各2μL;反应条为：94℃预变性5 min,然后94℃30 s,58 ℃(MMP-2 C1306T)、62 ℃(MMP-2 C735T)、或 65 ℃(MMP-9 C1562T)45 s,72℃45 s,30个循环后,72℃延伸10 m in。3种 PCR产物分别经 XspⅠ(MMP-2 C1306T)、HinfⅠ(MMP-2 C735T)和 PaeⅠ(MMP-9 C1562T)限制性内切酶酶切后分析基因型。结果见图1、2、3。

图1 PCR-XSPⅠ酶切的MMP-2 C1306T SNP基因型分型

图2 PCR-HinfⅠ酶切的MMP-2 C735T SNP基因型分型

图3 PCR-PaeⅠ酶切的MMP-9 C1562T SNP基因型分型

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件处理。用基因计数法计算单个基因型和等位基因频率。不同基因型和等位基因频率比较采用卡方检验。不同基因型别的预后比较,采用logistic回归分析,并对年龄、性别、既往病史、血脂、血糖、并发症、治疗等因素进行校正。

表1 缺血性脑卒中与对照组 MMP-2、MM P-9的基因型和等位基因频率 [例(%)]

2 结果

2.1 脑卒中组和对照组的一般临床资料 缺血性脑卒中组232例,男144例,女 88例;平均年龄(62.07±4.88)岁。对照组235例,男146例,女89例;平均年龄(60.86±9.92)岁。2组年龄、性别比较差异无统计学意义,有可比性。和对照组比较,脑卒中组吸烟者、合并颈动脉粥样硬化、收缩压、舒张压甘油三酯水平增高人数较多,差异有统计学意义(P＜0.05),而体重指数、血糖、总胆固醇水平虽然增高,但差异无统计学意义。

2.2 MMP-2基因C1306T、C735T和 MMP-9基因 C1562T基因型频数分布 表2结果显示,2组人群MM P-2基因C1306T、C735T和MM P-9基因 C1562T多态性基因型分布均处于H ardy-Weinberg平衡(P＜0.05),具有群体代表性。MMP-2基因C1306T的基因型和等位基因频率分布缺血性脑卒中各组(动脉粥样硬化性血栓性脑梗死组115例、脑栓塞组31例、腔隙性脑梗死组 86例)和对照组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。动脉粥样硬化性血栓性脑梗死组MMP-2基因 C735T的 CC基因型、C等位基因频率和MMP-9基因C1562T的CT+TT基因型频率和T等位基因频率明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 MMP-2、MMP-9不同基因型与预后的关系 在患者病后21 d及3个月进行随访。预后评价指标采用死亡和残疾。残疾采用Barthel Index(BI)评价,BI指数≤60分为依赖,BI＞60分为非依赖。缺血性脑卒中组发病21 d时死亡2例,残疾34例,到发病3个月时共死亡3例,残疾19例。死亡和依赖者为预后差。非依赖者为预后好。以预后为因变量,以年龄、性别、既往史、入院时病情严重程度、有无并发症、治疗和MMP-2基因 C1306T、C735T和MM P-9基因C1562T基因型为自变量,进行多因素Logistic回归分析,结果表明各基因型别与缺血性脑卒中预后无显著相关性(P＞0.05)。

3 讨论

缺血性脑卒中是一个多基因遗传疾病,目前为止,其确切发病机制及其病理生理过程仍不清楚。大量研究表明MMP-2、MM P-9通过降解细胞外间质(ECM),参与了动脉粥样硬化斑块的形成、迁移、破裂崩解;脑缺血后再灌注损伤、脑梗死后出血转化;神经元的凋亡等[1-5]。而与脑卒中的发生发展密切相关。

MMP-2基因定位于人类染色体16q21,包含多个SNPs,其中位于基因启动子区存在1306C→T和735C→T变异,体外实验已证实,C等位基因转录活性显著高于T等位基因[6-7]。本研究发现MMP-2基因C1306T的基因型和等位基因频率分布脑卒中各组和对照组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。而MMP-2基因C735T的CC基因型和C等位基因频率在动脉粥样硬化性血栓性脑梗死组明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),提示MMP-2 C735T的C等位基因与缺血性脑卒中的发病有关。我们推测,由于MMP-2 C735T的C等位基因频率明显高于对照组,导致基因转录水平增高,引起梗死区MMP-2表达增多,MMP-2降解 ECM,血脑屏障被破坏,进一步导致缺血性脑卒中患者血清MMP-2水平明显增高,造成卒中后继发性脑损伤。

MMP-9基因定位于人类染色体16q11.2-13.1,其中基因启动子区存在1562C→T变异。当C突变为T后,最终表现为启动子的活性增强,基因转录增强,蛋白质的表达量增加[8]。我们的研究发现MMP-9基因C1562T的CT+TT基因型频率和T等位基因频率在动脉粥样硬化性血栓性脑梗死组中明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。我们推测,脑梗死组T等位基因增高,即C突变为T增多,导致基因转录增强,MM P-9表达明显增加,促进动脉粥样硬化斑块的形成,增加斑块的不稳定性,斑块崩解、破裂,导致脑梗死的发生和梗死后继发性脑损伤,因此MMP-9 C1562T的T等位基因与缺血性脑卒中的发病相关。我们进一步研究发现 MM P-2基因 C1306T、C735T和 MMP-9基因C1562T各基因型别与脑卒中预后,无显著相关性(P＞0.05),国内未见相关报道。

综上所述,MMP-2 C735T的 C等位基因、MMP-9 C1562T的T等位基因是缺血性脑卒中遗传易感基因之一。然而,脑梗死发病机制复杂,是获得性危险因素如生活方式、高血脂、高血压、糖尿病等和种族、地域、环境、遗传性危险因素如基因多态性等共同相互作用所致,本研究样本含量较小,缺乏大规模、前瞻性特点,尚需扩大样本深入研究,也将为防治缺血性脑卒中带来新的方向。

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Study on polymorphisms ofmatrix metalloproteinase-2 and-9 genes,and clinical classification and prognosis of ischem ic stroke

Liu Dan,Wang Yachun,Sun Hongying,etal.Departmentof Neurology,the First A f filiated Hospita l,Baotou Medica l Col lege,Baotou014010,China

ObjectiveTo investigate theassociation betw een C1306T,C735T polymorphism ofmatrixmetalloproteinase-2 gene,C1562T polymorphism of matrix metalloproteinase-9 gene and ischem ic stroke.MethodsTwo hund red and thirty-two patientsw ith ischem ic stroke(115 cases of atherosclerotic thrombotic cerebral in farction,86 cases of lacunar infarc tion and 31 cases of cerebral embolism)and 235 healthy controlsw ere recruited.Polymerase chain reaction follow ed by restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detect C1306T,C735T po lymorphism of MMP-2 gene and C1562T polymorphism of MMP-9 gene.ResultsThere wereno significant differences in genotype frequency of C1306T polymorphism of MMP-2 gene between ischemic stroke and controls.CT and TT genotype frequency of C1562T polymorphism of MMP-9 gene and T allele,CC genotype frequency of C735T polymorphism of MMP-2 gene and C allele in atherosclerotic thrombotic cerebral infarction w ere higher than controls;there wasn't significant difference between lacunar infarction,cerebralembolism and controls.There w ere no significant correlations betw een different genotype of MMP-2,MMP-9 and p rognosis of ischem ic stroke by Logistic regression analysis.ConclusionThese results suggest that the C allele of C735T of MMP-2 gene and T allele of C1562T ofMM P-9 gene are one of genetic susceptiblegenes to atherosclerotic th rombotic cerebral infarction.Polymorphisms of matrixmetalloproteinase-2,-9 genes have no correlation with p rognosis of ischemic stroke.

Polymorphisms ofmatrixmetallop roteinase-2 and-9 genes;Ischem ic stroke;Clinica lclassification;Prognosis

R743.33

A

1673-5110(2011)07-0003-03

(收稿2011-01-17)