灯盏花素对顺铂所致豚鼠耳蜗损伤的拮抗作用

洪丽 赖晃文 熊敏

顺铂是临床上常用的抗肿瘤药物，其耳毒性已被人们充分认识，但是至今尚无有效的防治方法。顺铂所致的耳蜗损伤表现为双侧进行性感音神经性听力下降，并且常常不可逆。顺铂耳蜗损伤机制尚不完全清楚，目前公认活性氧(reactive oxygen species，ROS)在顺铂所致耳蜗损伤中起重要作用[1～3]。ROS作用于细胞蛋白、脂质和DNA而导致细胞损伤，其作用于质膜产生磷脂过氧化产物，包括4-羟基-2-壬烯醛(4-HNE)等，4-HNE是一种醛脂质过氧化产物，具有高度活性，能导致细胞的损伤和死亡。由于ROS活性极高，存在时间短，难以检测，故常以免疫组化方法检测4-HNE以判断ROS所致的氧化损伤[4]。灯盏花素具有抗氧化以及清除ROS的作用[5，6]，本研究拟观察灯盏花素对顺铂所致耳蜗毒性的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取30只健康杂色豚鼠,雌雄兼用,体重250 g左右,Preyer反射阳性,耳镜检查鼓膜未见异常。动物随机分为正常对照组(A组) 、实验对照组(B组) 、实验组(C组)，每组10只。

1.2实验方法

1.2.1各组动物用药方法 A组不做任何处理；B组和C组一次性腹腔注射顺铂10 mg/kg，同时C组连续10天腹腔注射灯盏花素15 mg·kg-1·d-1, B组同时程腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2ABR 检测方法 实验前后每组动物均检测ABR反应阈。将清醒状态的豚鼠置于特制固定架中,在隔声屏蔽环境中行双耳ABR检测,记录电极置于同侧耳垂,参考电极置于对侧耳垂,头顶电极接地。采用Pathfinder I 型听功能测试仪(Nicolet) 记录,声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管传入,短声刺激,带通滤波为100～3 000 Hz，平均叠加次数为500～1 000次,以波Ⅲ为基准判定反应阈。

1.2.3耳蜗取材 最后一次检测ABR后,各组豚鼠在全麻下开胸,以PBS 心脏灌流,在灌流液清亮时,改用4 %多聚甲醛灌注固定5 min。迅速取下双侧颞骨,左侧耳蜗用于检测4-HNE表达,右侧耳蜗用于扫描电镜检查。将左侧耳蜗置4 ℃ 4 %多聚甲醛液中,在解剖显微镜下摘除镫骨,用细针于蜗顶钻一小孔,轻轻以4 %多聚甲醛灌流耳蜗,耳蜗在4 %多聚甲醛中固定12 h 以上, PBS 漂洗数次,10 %EDTA 脱钙,石蜡包埋,切片,每片厚度6 μm。将右侧耳蜗置于4 ℃ 2 %戊二醛中,固定脱钙后行扫描电镜检查。

1.2.4免疫组织化学染色 三组豚鼠左侧耳蜗切片以二甲苯及酒精脱蜡后,TBS 漂洗10 ×3 min,2 %双氧水处理20 min ;TBS 漂洗10 ×2 min 后,0.2 % Triton - X处理10 min ;TBS 漂洗10 ×2 min ,5 %胎牛血清蛋白封闭60 min。加抗4-HNE抗体(以0. 8 %胎牛蛋白稀释为1∶300 , LSBio, 从兔血清制备) 在4 ℃冰箱过夜。加入二抗(羊抗兔, 用TBS 稀释为1∶400) 1 h ,TBS 漂洗后加入Strep - HRP (用TBS 稀释为1∶100) 1 h ,TBS 漂洗4 ×10 min 后,用含有硫酸镍的DAB显色液显色(阳性反应呈蓝黑色) ,显色在光镜下控制进行。阴性对照以0. 8 %胎牛蛋白代替抗4-HNE抗体,以实验对照组豚鼠肾脏切片为阳性对照。对三组豚鼠耳蜗4-HNE染色进行半定量分析[7]。

1.2.5耳蜗扫描电镜检查 各组豚鼠右侧耳蜗以2 %戊二醛固定、10 %EDTA 脱钙后,PBS 漂洗,1 %锇酸固定1 h。再次PBS 漂洗,剥除耳蜗骨壳,揭除前庭膜,暴露内外毛细胞,以40 %～100 %酒精脱水各40 min ,于100 %丙酮液中过夜。二氧化碳临界点干燥、粘托,真空喷金, 日立S-3000N型数字扫描电镜观察。

1.3统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行t检验分析。

2 结果

2.1ABR反应阈 三组豚鼠ABR反应阈见表1,造模前各组ABR反应阈差异无统计学意义(P>0.05)，顺铂腹腔注射后B、C 两组豚鼠ABR反应阈显著升高，均明显高于A组，B组明显高于C组(P<0.01)。

表1 各组豚鼠造模前后ABR反应阈(n=10只)

注：*与同组造模前比较，P<0.01；△与B组造模后比较，P<0.01

2.2免疫组织化学反应结果(表2) A组豚鼠耳蜗4-HNE反应阴性。B组耳蜗4-HNE反应呈强阳性(图1a) ,而且在耳蜗的各回均呈阳性；在Corti器、Hensen细胞、Deiter细胞、内外柱细胞、边缘细胞4-HNE反应均呈阳性;内、外毛细胞4-HNE染色呈弱阳性；蜗神经4-HNE染色在光镜下呈阴性，4-HNE在血管纹和螺旋神经节细胞的反应呈强阳性。C组豚鼠耳蜗4-HNE染色呈弱阳性(图1b), 其染色明显较B组浅。可见4-HNE在顺铂损伤耳蜗中呈阳性表达, 灯盏花素对4-HNE活性有明显的抑制作用。

表2 各组豚鼠耳蜗各部位4-HNE表达

注：-:阴性，+～++：弱阳性，++++：强阳性

2.3耳蜗扫描电镜观察 A组未观察到毛细胞的损伤和缺失(图2a)。B组耳蜗钩端及基底回呈现多数大片状外毛细胞缺失,内毛细胞无明显缺失(图2b);第2、3回外毛细胞呈局灶性缺失。C组耳蜗钩端及基底回呈散在外毛细胞缺失(图2c) ,第2、3回呈个别外毛细胞缺失。

3 讨论

目前顺铂的耳毒性机理不完全清楚，研究认为是ROS损伤所致[1～3]。ROS使细胞内的抗氧化物消耗，谷胱甘肽是抗氧化通路中的重要物质，在顺铂损伤小鼠耳蜗中的含量显著下降，而细胞内氧化自由基代谢产物丙二醛的含量显著增加[8,9]。ROS与耳蜗细胞膜磷脂反应可产生醛类物质，其中4-HNE能引起耳蜗听觉细胞和神经元的凋亡[10，11]。

顺铂耳毒性的防治主要是应用抗氧化剂治疗[12]，也有报道血管内皮生长因子能拮抗其耳毒性[13]。灯盏花素系菊科植物灯盏花中提取物，现代药物研究证明,灯盏花素具有增加血流量、改善微循环、扩张血管、降低血粘度、降血脂、促纤溶、抗血栓、抗血小板聚集等作用。近几年,随着研究的深入,发现灯盏花素有抗氧化作用，临床应用范围不断拓宽[14]。

图1 B、C两组豚鼠耳蜗4-HNE表达(标尺均为10 μm)a1: B组血管纹及耳蜗外侧壁4-HNE为强阳性；a2: B组耳蜗外毛细胞4-HNE为强阳性；a3: B组耳蜗螺旋神经节细胞4-HNE为强阳性b1:C组血管纹及耳蜗外侧壁4-HNE为弱阳性；b2: C组耳蜗外毛细胞4-HNE为弱阳性；b3: C组耳蜗螺旋神经节细胞4-HNE为弱阳性

图2 A、B、C组豚鼠耳蜗扫描电镜观察(标尺：10 μm)a：A组未见毛细胞缺失及损伤； b：B组见大片外毛细胞缺失； c：C组见局灶性外毛细胞缺失

4-HNE是耳蜗ROS氧化损伤的产物，是氧化损伤的一个可靠指标[4]，4-HNE表达较强表明ROS氧化损伤重，其表达弱表明ROS氧化损伤轻。本实验结果表明应用顺铂后，4-HNE在B、C两组耳蜗中均有表达,尤其在血管纹与螺旋神经节表达呈强阳性。但应用了灯盏花素的C组4-HNE的表达明显较B组弱，且C组耳蜗毛细胞的损伤程度也明显较B组轻，C组ABR反应阈也明显低于B组，说明灯盏花素能抑制4-HNE在顺铂损伤耳蜗中的表达，同时能减轻耳蜗外毛细胞损伤和ABR反应阈阈移。可见顺铂触发耳蜗形成ROS[1～3]，而ROS能激发耳蜗细胞的凋亡和坏死[11]，ROS在血管纹表达强阳性，能引起耳蜗血管纹的损伤,血管纹是整个耳蜗包括内外毛细胞及支持细胞能量的主要来源[15，16],血管纹的损伤可导致耳蜗功能的失调。而灯盏花素通过抑制ROS的形成对顺铂致耳蜗的损伤起拮抗作用。

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