灯盏花素DSPE-PEG 聚合物胶束的制备及体外性质研究

颜寅萍，李霞，吴俊珠

(云南省昆虫生物医药研发重点实验室(大理大学)，大理大学药学与化学学院，云南 大理)

0 引言

灯盏细辛又名灯盏花、灯盏草，为菊科飞蓬属植物短葶飞蓬的干燥全草，以根或全草入药，主要分布于我国西南地区，云南、广西、湖南、贵州等地，用于治疗头痛、风湿痛、脑血管疾病引起的瘫痪；对高血压、脑溢血、脑血栓形成、脑栓塞、多发性神经炎、慢性蛛网膜炎及其后遗症具有较好疗效，并对风湿病、冠心病也有一定疗效[1,2]。灯盏花主要化学成分为黄酮类和黄酮苷类、芳香酸脂类、挥发性油类、咖啡酰类、单体化合物类等[3]。灯盏花素 (breviscapine) 为灯盏花的有效成分，是灯盏花中的一类总黄酮，内含灯盏花甲素和乙素，其中灯盏乙素占90% 以上。灯盏乙素(scutellarin) 又名野黄芩苷，是对心脑血管疾病起效的活性成分。灯盏乙素具有改善脑梗塞，增加脑血流量，降低血管阻力和抗血小板凝聚的作用；促进纤溶，具有良好的溶栓作用；临床用于心脑血管疾病，如脑供血不足、脑出血所致后遗症、急性脑梗死，缺血性脑卒中和冠心病等治疗[4-7]。目前已经上市的灯盏花素制剂有口服制剂、注射剂，存在半衰期短、生物利用度低等问题[8]。

两亲性聚合物在水溶液中能自发形成聚合物胶束，亲水性嵌段形成外壳，疏水性嵌段形成内核，在水中形成结构紧密的核-壳结构，可以包载脂溶性分子，具有良好的稳定性、体内缓慢释药，增加药物的稳定性和提高生物利用度的作用[9]。王志玉等以DSPEPEG 2000 为载体材料制备多西紫杉醇胶束，所制备出来的胶束包封率高，24 h 累积释放百分率小于30%[10]。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000) 是在体内可降解并经美国食品药品管理局(FDA)批准的可用于人体的药物载体材料，具有良好的生物相容性和安全性[11]。聚合物胶束作为纳米递药系统可以达到缓释及延长药物作用时间的目的。本文以DSPE-PEG 2000 为载体材料，采用薄膜水化法将难溶性药物灯盏花素制备成灯盏花素DSPE-PEG 聚合物胶束，对其包封率和体外释放度进行研究，为后续开展体内研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

KQ5200DB 型数控超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司)，TU-1901 双光束紫外可见分光光度计( 北京普析通用仪器有限责任公司)，HWS-24 电热恒温水浴锅( 上海一恒科学仪器有限公司)，Agilent1200 高效液相色谱仪( 美国Agilent G1314B VWD 型紫外检测器)，TGL-20B 离心机(上海安亭科学仪器厂)，Zetasizer Nano ZS90 粒度测定仪(英国 Malvern 公司)，JEM-2100F 型透射电镜(日本电子)，LYZ 恒温摇床(上海龙跃仪器设备有限公司)。

1.2 材料

灯盏花素标准品(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：Z17O7X22900)，灯盏花素原料药(南京景竹生物科技有限公司)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000(1，2-distearoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000])(DSPE-PEG2000)( 西安瑞喜生物科技有限公司，纯度≥95%)，色谱甲醇(利安隆博华医药化学有限公司)，其他试剂均为实验室分析纯级别。

2 方法

2.1 灯盏花素聚合物胶束的制备

采用薄膜水化法制备灯盏花素聚合物胶束，称取20.0mg DSPE-PEG 2000 加入氯仿中，超声溶解，称取4.0mg 灯盏花素加入甲醇中，超声溶解，将灯盏花素的甲醇溶液滴加到DSPE-PEG 2000 溶液中，氮气下吹干，除尽有机溶剂，形成含药脂膜，加入超纯水8mL 后，通氮气保护，37℃水合45min，室温放置1h 后，将制得的胶束过φ0.22um 滤头[12]。

2.2 灯盏花素聚合物胶束的表征

取一滴灯盏花素聚合物胶束滴于铜网上，空气中放置10min，待干燥后滴加2% 的磷钨酸溶液，放置5min，干燥后测定。用ZS90 型粒度测定仪测定胶束的粒径、PDI 指数和zeta 电位。

2.3 波长的选择

吸取适量灯盏花素溶液，放入棕色量瓶中，加入适量的甲醇溶液进行稀释、定容至刻度线处，摇匀，配置成0.01mg/mL 的灯盏花素溶液，以甲醇为空白参比，用UV 法进行紫外吸收波长扫描来确定其最大吸收波长。吸取适量的DSPE-PEG2000 储备液，用甲醇溶解稀释，用UV 法进行紫外吸收波长扫描。

2.4 色谱条件

色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB-C18 (4.6×250mm，0.5 um)；流动相：( 甲醇：0.1% 磷酸溶液)。流速：0.8mL/min；检测波长：335nm；柱温 25℃；进样量为10ul。

2.5 溶液的制备

0.1 mg/mL 的灯盏花素样品溶液的制备：精密称取1.0mg 的灯盏花素原料药，放入10mL 棕色容量瓶中，加入适量甲醇溶液待其完全溶解后定容，制备0.1mg/mL 的灯盏花素样品溶液。

0.1 mg/mL 的灯盏花素标准品溶液的制备：精密称取1.0mg 的灯盏花素标准品，放入10mL 棕色容量瓶中，加入适量甲醇溶液待其完全溶解后定容，制备0.1mg/mL 的灯盏花素标准溶液。用甲醇溶液做为空白组，按照上述色谱条件，用HPLC 检测。

2.6 标准曲线的建立

配制不同浓度的灯盏花素标准品溶液，浓度分别为4.0，6.0，8.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0，40.0ug/mL，按照HPLC 法在335nm 处对这一系列标准品溶液进行测定，得出这一系列标准品溶液的峰面积(S)，以峰面积值对质量浓度(C)进行线性回归，绘制标准曲线。

2.7 精密度及方法回收率考察

分别配制二组低、中、高(20.0、30.0、40.0ug/mL) 三种不同浓度的灯盏花素标准品溶液，每个浓度设置三个平行组，第一组标准品样品进HPLC，考察回收率。第二组标准品样品同一天内测定5次峰面积(S)，考察其日内精密度，计算RSD。同法，用上述第二组标准品样品每天测定1 次连续测定3 天峰面积(S)，考察其日间精密度，计算RSD。

2.8 灯盏花素聚合物胶束中灯盏花素包封率的测定

采用微孔滤膜法测定药物包封率：精密吸取过滤后的灯盏花素聚合物胶束，加甲醇破坏胶束，以4000 r/min 的速度离心10 min，取上清液至10 mL 容量瓶中，用流动相定容，φ0.22μm 微孔滤膜滤过，HPLC 法测定包封率。

2.9 释放介质的选择

灯盏花素溶液的稳定性随温度和pH 升高而降低，在进行体外释放研究时，为了接近体内的生理条件，释放介质的pH 选择在7.4，温度选择在37℃。有研究表明一定浓度的EDTA-2Na 能明显改善灯盏花素的稳定性[13]。最终选择的缓冲介质为pH 7.4 的Tris-EDTA 缓冲液。

2.1 0 聚合物胶束的体外释放实验

分别取0.37mg/mL 的灯盏花素聚合物胶束及0.37mg/mL 的甲醇溶解的灯盏花素原料药各2mL，分别放入预先处理好的透析袋中，每个样品配置3 份。将透析袋分别放入20.0mL 释放介质中，采用恒温振荡法，37℃水浴避光恒速100r/min 振摇，分别在0.083、0.17、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、12、24h，用移液枪精密吸取1mL 释放介质，稀释后采用HPLC 法测定，补充同温等量的释放介质。采用HPLC 法测定样品的峰面积(S)，计算累计释放率，绘制释放曲线。

3 结果

3.1 灯盏花素聚合物胶束的表征

结果见表1 和图1、图2、图3。灯盏花素聚合物胶束zeta 电位为-29.6mV。在TEM 观察下呈形状大小均匀的球形或类球形。

3.2 波长的选择

分别取灯盏花素甲醇溶液和DSPE-PEG 2000 甲醇溶液进行紫外扫描，确定灯盏花素检测波长，其结果见图4。从图4 结果显示，灯盏花素在289nm 和335nm 都有显著吸收峰，DSPE-PEG 2000 在289nm 波长处对灯盏花素有一定干扰，而在335nm 波长处几乎没有吸收。故选择335nm 为含量测定的紫外吸收波长。

3.3 色谱条件

HPLC 结果见图5。

3.4 标准曲线的建立

其 线 性 方 程 为：Y=13.77X+4.2819，R2=0.9995。 表 明 在4.0～40.0ug/mL 范围内，峰面积(S) 和不同浓度(C) 的灯盏花素溶液之间存在着良好的线性关系。

3.5 精密度及方法回收率考察

日 内 精 密 度RSD 为0.50%，0.46%，0.17%，日 间 精 密 度RSD 为0.16%，0.05%，0.02%，平 均 回 收 率 为99.02%，98.80%，101.34%，RSD 分别为0.13%，0.10%，0.03%。RSD 值均小于3%，满足含量测定的要求。

表1 灯盏花素聚合物胶束的表征

图1 灯盏花素聚合物胶束的粒径分布图，a 空白胶束b 灯盏花素聚合物胶束

图2 灯盏花素聚合物胶束的zeta 电位分布图

图3 灯盏花素聚合物胶束TEM 图

图4 灯盏花素和DSPE-PEG 2000 的UV 吸收光谱图

图5 HPLC 色谱图 A：灯盏花素标准品，B：灯盏花素原料药样品，C：破乳后的灯盏花素

3.6 灯盏花素聚合物胶束中灯盏花素包封率的测定

结果见表2，灯盏花素/DSPE-PEG 2000 的包封率为(83.78±2.52)%，载药量为(14.3±1.89)%(n=3)，且重复性和稳定性良好。

表2 灯盏花素聚合物胶束的包封率和载药量

3.7 灯盏花素聚合物胶束的累积释放曲线

结果如图6，5h 时原料药、载药聚合物胶束的累积释放百分率分别为86.76% 和57.89%。24h 时原料药、载药聚合物胶束的累积释放百分率分别为100%和75.35%。结果提示，灯盏花素聚合物胶束具有一定的缓释作用。

图6 灯盏花素累计释放百分率(n=3)

4 讨论

本研究以DSPE-PEG 2000 为载体材料采用薄膜水化法制备灯盏花素聚合物胶束，对制备的灯盏花素胶束进行体外性质研究，聚合物胶束具有适宜的包封率。体外释放实验表明，灯盏花素聚合物胶束相对于灯盏花素原料药具有一定的缓释作用，可能对灯盏花素在血浆中的药物浓度的维持具有帮助，本研究可为后续开展体内研究提供参考依据。