松果腺对大鼠肺脏免疫功能季节性变化影响的实验研究*
2011-01-23袁卫玲马淑然郭霞珍顾晓静徐巍华赵树宏天津中医药大学中医学院天津30093北京中医药大学基础医学院北京0009
袁卫玲,马淑然,郭霞珍,顾晓静,徐巍华,赵树宏(.天津中医药大学中医学院,天津 30093;.北京中医药大学基础医学院,北京 0009)
根据中医天人相应理论,自然界的季节变化对人体的生理病理具有重要的影响作用。现代生物学研究也表明,人体内存在一种受到光照调节并具有高位调控作用的组织-松果腺,它分泌的褪黑素(Melatonin,简称Mel)通过视觉和皮肤两条生物信号转导通路使其分泌与太阳光的运动同步,具有昼夜和季节性节律。Mel具有重要的免疫调节功能,不仅影响免疫器官的生长发育,而且对体液和细胞免疫均起到调节作用。研究表明,Mel与肺脏免疫密切相关[1],它与肺组织上分布的褪黑素受体(Melatonin receptor,简称MR)结合,由G蛋白介导,通过级联放大效应对第一、第二等信号物质发挥作用,对肺部免疫直接产生影响。此外,Mel的自由基清道夫和抗氧化剂活性作用,能降低其调控的诱导型一氧化氮合成酶活性及支气管肺泡灌洗液中一氧化氮含量,减轻哮喘大鼠气道炎症和气道高反应性[2]。由于松果腺-褪黑素既具有季节性节律,又能对肺脏免疫产生直接或间接调节作用。因此,本实验采用松果腺摘除动物模型,通过观测大鼠肺泡灌洗液中(BALF)中免疫相关物质的变化,来探讨松果腺对大鼠肺脏免疫功能季节性变化影响的作用机制。
1 材料
1.1 动物
健康Wistar大鼠 SPF级,雄性96只,体重160g±10g,分别于春分、秋分、夏至、冬至前40d由北京维通利华实验动物技术有限公司购入,实验动物许可证号SCXK(京)2007-0002。饲养条件:自然光照(不加人工照明),室温、湿度自然,自由摄取水及饲料。
1.2 主要仪器和试剂
低温高速离心机(美国 BECKMAN公司产),PW2003型培养箱(重庆四达实验仪器厂),307-2B型牙科台式电钻机(上海医疗器械厂),BIO RAD 550酶标仪(美国博乐公司产),OLYMPUS BX5显微镜(日本OLYMPUS珠式公社),Hanks液(购自北京化学试剂公司),小牛血清白蛋白(购自北京骏腾生物技术有限公司),鸡静脉血(购自北京实验动物研究中心),IL-2、IFN-γ和 sIgA(RD进口分装,均购自北京博惠嘉业生物技术有限公司)。
2 方法
2.1 分组
随机分为生理组、手术组(松果腺摘除模型组)和伪手术组,每组各8只。手术组、伪手术组分别于春分、秋分、夏至、冬至(以下简称二分、二至)前1个月施行手术造模,与生理组动物在相同条件下饲养到二分、二至当日20∶00以后处死取材。
2.2 动物造模与检测方法
2.2.1松果腺摘除动物模型 10%水合氯醛3~4ml/kg腹腔注射麻醉、固定、消毒,头顶皮肤切口约2cm,暴露颅骨矢状缝和人字缝。在人字缝和矢状缝两侧用牙科钻切割矩形骨片,暴露矢状静脉(SSV)和横向静脉窦(TS),沿SSV两侧纵向切开硬脑膜,双侧结扎SSV,剪断并向后翻转断端靠近窦汇(CS)端,用眼科镊摘取出松果腺,把SSV放回原位,放置少许明胶海绵止血、清创,点适量青霉素干粉预防感染,缝合皮肤并消毒,创口再点适量青霉素干粉。术后注射青霉素注射液3d。
2.2.2 伪手术动物模型 操作过程同上,只是向后翻转SSV断端后,不摘除松果腺,也不将镊子尖端伸入窦汇下,以避免对松果腺及其神经纤维的损伤。
2.2.3 肺泡灌洗液的获取 分别于二分、二至当日20∶00时,将大鼠麻醉固定,随即开胸暴露气管。用棉线结扎离心端,在其下方2个软骨环间做一切口并插入导管,导管与5ml注射器连接,从支气管分叉处用棉线结扎右侧支气管,用4℃生理盐水4ml进行左肺灌洗,注射器抽吸6遍,回收液约为2ml~2.5ml,将回收液低温4℃ 2000r/min,离心15min将上清液收集、分装,-70℃低温冰箱储存备用。
2.2.4 肺泡灌洗液中巨噬细胞(AM)吞噬功能的测定 鸡红细胞吞噬法[3]。
2.2.5 肺泡灌洗液中 IL-2,IFN-γ和 sIgA的测定 酶联免疫吸附实验(ELISA法)。
2.3 统计学方法
各组数据均用均数 ±标准差表示,运用SPSS11.5统计软件分析。各季节组内及4季节每组间比较均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验,以P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。
3 结果
3.1 松果腺对大鼠 BALF中 IL-2和 IFN-γ四季含量变化影响的比较
表1显示,与同一季节比较,春分时 IL-2和IFN-γ手术组含量显著低于生理组(P<0.05)。全年IL-2和IFN-γ伪手术组与生理组相比,无显著差异(P>0.05)。
与不同季节比较,生理组:IL-2春分、夏至高于秋分,差异十分显著(P<0.01);春分高于冬至,差异十分显著(P<0.01);夏至显著高于冬至(P<0.05)。IFN-γ春分、夏至显著高于秋分和冬至(P<0.05)。手术组:IL-2夏至显著高于秋分(P<0.05),IFN-γ夏至显著高于春分、秋分和冬至(P<0.05,P<0.01)。
表1 松果腺对大鼠BALF中IL-2和IFN-γ含量四季变化影响的比较
表1 松果腺对大鼠BALF中IL-2和IFN-γ含量四季变化影响的比较
注:与同一季节生理组比较:*P<0.05;与同组春分比较:★P<0.05;与同组秋分比较:#P<0.05,##P<0.01;与同组冬至比较:△P<0.05,△△P<0.01
季节n IL-2 IFN-γ生理组 手术组 伪手术组 生理组 手术组 伪手术组春分 8 102.937±20.764##△△ 74.217±23.774*94.443±22.373 131.452±27.235#△ 102.489±15.288*125.910±29.270夏至 8 92.848±14.515##△ 85.775±14.752#75.116±25.849 128.723±28.390#△ 126.921±24.056★#△△123.472±25.715秋分 8 63.794± 6.509 66.582± 8.099 74.937±20.150 95.516±15.931 100.370±18.316 112.207±14.185冬至 8 73.137±17.856 69.445± 9.502 77.848±10.71096.029±30.015 90.748±18.201 99.246±23.476
3.2 松果腺对大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季变化影响的比较
表2显示,与同一季节比较,春分时,sIgA手术组显著低于生理组和伪手术组(P<0.05);秋分时,手术组、生理组显著低于伪手术组(P<0.05,P<0.01);除秋分外,其余3季生理组与伪手术组相比,无显著差异(P>0.05)。夏至时,AM吞噬率手术组显著低于生理组(P<0.05);冬至时,手术组显著低于伪手术组(P<0.05);全年AM吞噬率伪手术组与生理组相比,无显著差异(P>0.05)。
与不同季节比较,生理组:sIgA秋分低于春分和夏至,差异极显著(P<0.01);冬至显著低于春分和夏至(P<0.05)。伪手术组:sIgA冬至显著低于春分(P<0.05)。手术组:sIgA春分显著低于夏至(P<0.05);秋分、冬至低于夏至,差异极显著(P<0.01)。
表2 松果腺对大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季变化影响的比较
表2 松果腺对大鼠BALF中sIgA含量和AM吞噬率四季变化影响的比较
注:与同一季节生理组比较:*P<0.05,**P<0.01;与同一季节伪手术组比较:#P<0.05;与同组春分比较:☆P<0.05;与同组夏至比较:★P<0.05,★★P<0.01;与同组秋分比较:△△P<0.01;与同组冬至比较:▲P<0.05
季节n sIgA(pg/ml)AM吞噬率(%)生理组 手术组 伪手术组 生理组 手术组 伪手术组春分 8 5.619±1.000△△▲ 3.925±0.775*#★ 5.405±1.530 39.480±13.532 37.276±13.536 36.436±15.084夏至 8 5.494±1.362△△▲ 5.183±0.850 5.061±1.498 45.306±10.821 32.885± 5.656* 36.430±12.797秋分 8 2.974±1.072 3.311±0.499#★★ 4.795±1.211** 37.795±11.837 34.892±10.265 44.597±11.735冬至 8 3.817±1.114 3.615±1.126★★ 3.893±1.0641☆ 38.480±11.891 33.566± 7.571#48.108± 8.466
4 讨论
4.1 松果腺对大鼠肺脏免疫调节以增强为主
考虑到松果腺摘除手术操作过程可能会对实验结果造成影响,如应激反应,故专门设立伪手术组以作对照。由于松果腺分泌的Mel不仅具有季节节律,还有昼夜节律,血液Mel含量白天低而夜间高,且最高含量值出现在凌晨2∶00~3∶00,为了使手术组和伪手术组更明显、更准确地与生理组比较,故在二分、二至当日20∶00后取材。
在细胞免疫中,细胞因子白细胞介素-2(IL-2)主要由活化的Th1细胞产生,它的生物活性是刺激多种细胞的生长和分化,包括T淋巴细胞和自然杀伤性细胞(NK细胞)的增殖,促进活化的B细胞分化、增生和分泌免疫球蛋白,同时也通过作用于单核细胞,促进其分泌 IL-1。有研究显示[4、5],在慢性支气管炎动物模型中肺组织和外周血中IL-2含量明显降低。另一重要的细胞因子 γ-干扰素(IFN-γ)具有干扰病毒感染和复制的能力,它主要能活化T细胞和NK细胞产生,可直接促进T、B细胞分化和细胞毒性T细胞(CTL)成熟,刺激B细胞分泌抗体,具有强大的免疫调节作用。由于呼吸道感染的病原中病毒占重要地位,故IFN-γ的特异性防御机制极为重要。在体液免疫中分泌型IgA(sIgA)是呼吸道黏膜的主要保护性抗体,也是机体抗感染的一道重要的“屏障”,能阻止细菌附着在黏膜的表面溶解细菌,并可中和病毒和毒素。在肺脏的非特性免疫功能中肺泡巨噬细胞(AM)较强的吞噬杀伤能力,可非特异性吞噬杀伤多种病原微生物,在人体防御各种各样的致病因素入侵的过程中发挥极其重要的作用。AM主要分布于呼吸道、肺泡表面,约占BALF细胞总数的90%以上。肺脏具有不断暴露于外界异物侵入的特殊性,AM吞噬功能的强弱则与肺部感染密切相关。由于 IL-2、IFN-γ、sIgA和 AM与肺脏免疫关系密切,故本实验选取IL-2和IFN-γ反映肺脏的细胞免疫功能,sIgA反映体液免疫功能,AM吞噬率代表非特异性免疫功能。
本研究结果显示,正常生理情况下,全年大鼠BALF中 IL-2、IFN-γ、sIgA含量和 AM 吞噬率均呈现春夏高于秋冬的变化趋势,而伪手术组 IFN-γ和sIgA含量也呈现春夏高于秋冬的变化特点,与生理组变化一致。另外除sIgA秋分外,其余指标生理组与伪手术组四季比较无显著性差异,说明本实验手术操作过程基本不影响BALF中相关免疫物质含量的变化。
摘除松果腺后,BALF中AM吞噬率四季数值虽均较生理组有下降的变化特点,其中夏至手术组比生理组显著降低。IL-2、IFN-γ和sIgA含量,除秋分时数值略升高外,其余3个季节数值均较生理组有下降的趋势。其中春分、冬至时,手术组IL-2、IFN-γ和sIgA含量低于生理组和伪手术组,以IL-2和IFN-γ含量显著低于生理组(P<0.05),sIgA含量显著低于生理组和伪手术组(P<0.05)。虽然这3个指标在秋分时摘除松果腺手术组较生理组数值升高,但手术组与生理组、伪手术组之间无显著性差异,仅仅有略升高的变化趋势而已。这种升高可能是季节性因素造成的,亦可能是大鼠对手术创伤的应激性反应。可见,松果腺对BALF中免疫相关物质调节以增强作用为主。
4.2 松果腺对大鼠肺脏免疫调节具有季节选择性
摘除松果腺手术后,BALF中 IL-2、IFN-γ和sIgA含量除秋分时数值略升高外,其余3个季节数值均较生理组有下降的特点,以春分时显著(P<0.05),说明松果腺在春分时对 IL-2、IFN-γ和 sIgA的免疫上调作用显著。而AM吞噬率四季手术组数值均较生理组有下降的特点,以夏至时显著(P<0.05),说明松果腺在夏至时对AM有显著的免疫上调作用。可见,松果腺在不同的季节对免疫物质的调节作用不完全一致,它对大鼠肺脏免疫调节功能可能具有季节选择性,这也与我们前期研究结论相吻合[6]。但松果腺对不同免疫物质季节选择性的具体调节免疫机制仍有待于进一步深入研究。
4.3 松果腺对大鼠肺脏免疫功能季节性变化的影响具有复杂性
全年生理组大鼠 BALF中 IL-2、IFN-γ、sIgA含量和AM吞噬率存在春夏高于秋冬的季节节律性,但松果腺摘除后除 AM吞噬率外,IL-2、IFN-γ和sIgA含量仍表现为春夏高于秋冬的变化特点,只是生理组以春分含量最高为显著,而手术组以夏至含量最高为显著,但生理组与手术组的整体变化趋势提示松果腺对大鼠肺脏免疫功能季节性变化的影响不具有惟一性。分析其原因可能为,松果腺虽然主要分泌褪黑素,但不是内源性褪黑素的惟一来源。研究发现,视网膜、卵巢、肾上腺、睾丸、周围神经、交感神经、脑垂体和甲状腺等组织中亦有表达。将实验大鼠松果腺摘除后,血内仍可测得褪黑素,说明尚有次级分泌来源[7]。而本实验摘除松果腺后大鼠肺脏免疫功能仍部分存在着春夏高于秋冬的季节节律性,表明除松果腺外,可能有其他内源性褪黑素的分泌影响着肺脏的免疫功能。
由本实验可发现,松果腺作为“授时因子”,能感受光照刺激,高位调节人体免疫功能,但对肺脏局部免疫调节并非在每个季节对每个指标都有影响,且在不同的季节调节作用不一致,不能单一地概括为上调或下降,因此松果腺对肺脏免疫功能季节性变化调节不具有惟一性而较复杂。但总体上来看,松果腺对机体肺脏局部免疫以上调作用为主。除光照外,温度、湿度等其他外界因素也影响着松果腺分泌Mel的生理效应,进而影响肺脏免疫功能。肺脏免疫功能季节性变化节律的形成受影响的因素非常多,Mel作为神经内分泌激素之一,与肺脏免疫有十分密切的联系,两者之间的节律性变化是否有某种内在紧密联系,其间相关性和作用机制值得进一步深入探讨。
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