壮骨止痛方水提B部位对去势雌鼠骨质疏松的疗效及机理研究

甘国兴，莫新民△，李劲平，张国民，范娟娟，刘仕杰

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007;2.中南大学药学院，湖南 长沙 410013)

原发性骨质疏松症(Osteoporosis OP)是一种全身性骨骼疾病，已成为影响老年人身体健康和生活质量的严重社会问题。壮骨止痛胶囊是由壮骨止痛方依据中医理论结合现代药理研究研制而成，具有补益肝肾、壮骨止痛功效，能有效治疗骨质疏松症，已获得国家新药证书(国药证字Z20050125)。为明确其药效成分及其作用机理，我们课题组用不同溶剂从壮骨止痛方药中提取了6个部位，现在将水提B部位的疗效及其可能的作用机制报告如下。

1 材料

1.1 动物与饲料

3月龄SD雌性大鼠75只，体重250g左右，SPF级，广东省医学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2008－0002。饲料由标准普通饲料湖南中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药品与试剂

壮骨止痛方水提B部位及壮骨止痛方(原材料购自九芝堂，由中南大学药学院天然药物化学系制备)、雌激素(HY-032)、PTH(HY-105)、CT(HY-085)、BGP(HY-084)放免试剂盒(北京华英生物技术研究所)。

1.3 主要仪器

Unigamma骨密度仪(意大利)、JY3002型电子天平、低温离心机、LEICA DM LB2型双目显微镜、超低温冰箱、万能力学仪、MIAS医学图像分析系统、Motic B5显微摄像系统、GC-1500 r放射免疫计数器、JEOL-1230型透射电镜(日产)等。

2 方法

2.1 分组及造模方法[1]

采用国内外公认的雌性大鼠去卵巢3个月造成绝经后骨质疏松症病理模型。大鼠适应性饲养1周，随机分出空白组和假手术组各15只，除空白组外，其余的用2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g体重)麻醉，在无菌条件下从距离大鼠胸腰椎外侧1cm处纵向切开皮肤及两侧肌肉，摘除双侧卵巢，假手术组仅在卵巢周围切除相应重量的脂肪，分两层缝合伤口并用生理盐水擦洗干净血迹，术后连续3d大腿肌肉注射青霉素，每只大鼠4万u/d，术后5d拆线，饲养于室温23℃ ～25℃、相对湿度40% ～60%的清洁环境中，自由摄食和摄水。术后1周将模型大鼠随机分为模型组、壮骨止痛方组、水提B部位组，加上假手术组和空白组共5组，每组15只。

2.2 给药方法

各组均从第5天拆线后开始给药，每天灌胃1次，连续13周。空白组、假手术组和模型组每天灌胃相应体积冷开水和油中王牌植物油，其余各组开始灌胃相应药物(水相 0.6 ml/100g·d，油相0.4ml/100g·d)。剂量按各药效相关物质相对壮骨止痛方的得率及人鼠体表面积折算确定。

2.3 指标检测

连续灌胃13周，每10d称1次体重，13周之后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.2ml/100g)麻醉后，腹部切口分离腹主动脉，用负压采血管采血8ml，静置 2h～3h，3000r/min离心 15min后分离血清，以备放射免疫法检测相关指标。剖取左右后肢完整的股骨、胫骨及第2～4腰椎，去除上面附着的肌肉组织，保留骨膜并做相关检查。

2.3.1 子宫称重 打开腹腔，从子宫与阴道分界处剪断，仔细分离出双侧子宫，除掉周围的脂肪组织，用分析天平称取湿重。

2.3.2 检测放免法检测雌激素、PTH、CT、BGP。

主要从植物群落的外貌特征、景观结构、空间特征、游憩利用现状4个方面对样方进行调研。详细记录各个样方地理位置、植物种类、数量、特征数据(高度、冠幅、胸径、多盖度等)、生境条件等。同时根据植株干、枝、叶的生理性状评估树木的生长势,描绘样地平面图,并拍摄照片以作为其平面分布和竖向景观的有效补充。

2.3.3 骨密度检测 取右侧股骨、T2～T4腰椎骨用湿纱布包裹，送湖南中医药大学附一院骨密度室检测骨密度。

2.3.4 骨生物力学检测 取左侧胫骨分干净肌肉，用湿纱布包裹送国防科技大学物理系检测骨最大弹性应力、最大抗弯强度。

2.3.5 骨组织病理学检测 取左侧股骨，用4%的多聚甲醛固定48h，然后用5%的硝酸脱钙1周，送湖南中医药大学病理检验中心检测股骨头区域的病理组织形态学变化，测量股骨头平均骨小梁密度。

2.3.6 透射电镜检测 取右侧胫骨分离肌肉，用2.5%的戊二醛固定24h，然后用5%的硝酸脱钙1周送中南大学电镜室检测。

2.4 统计方法

数据处理采用SPSS16.0统计软件进行方差分析，实验数据以平均值±标准差表示，组间比较采用t检验作为显著性分析。

3 结果与分析

3.1 对去势骨质疏松模型雌鼠子宫湿重影响

表1显示，与模型组比较，水提 B部位组雌鼠子宫湿重有所增加，但无差异性(P>0.05)。

3.2 对去卵巢雌性骨质疏松模型大鼠骨密度的影响

表2 壮骨止痛方水提B部位对去势骨质疏松模型雌鼠骨密度的影响

3.3 对去卵巢雌性骨质疏松症大鼠左后支胫骨生物力学的影响

表3显示，与模型组相比，水提B部位能够显著提高去势骨质疏松模型雌鼠左后肢胫骨最大应力和最大抗弯强度(P<0.05)，提高骨生物力学性能。

表3 壮骨止痛方水提B部位对去势骨质疏松模型雌鼠左后肢胫骨生物力学的影响

3.4 对去卵巢雌性骨质疏松症大鼠血清E2、BGP、PTH、CT 的影响

表4显示，与模型组比较，壮骨止痛方水提 B部位能够显著降低去势骨质疏松模型雌鼠血清CT(P<0.05)，有升高去势骨质疏松模型雌鼠血E2的趋势，但无差异性(P>0.05);血清 BGP、PTH比模型组略高。

表4 壮骨止痛方水提B部位对去势骨质疏松模型雌鼠血清E2、BGP、PTH、CT的影响

3.5 对去势骨质疏松模型雌鼠左股骨组织形态学的影响

附图显示，空白组、假手术组动物骨小梁分布均匀，股骨颈梁髓比正常。去卵巢模型组骨小梁稀疏、破坏，骨髓腔扩大，梁髓比明显下降。壮骨止痛方组和水提B部位组骨小梁密度分布比较均匀，梁髓比基本恢复正常，镜下可见成骨细胞。

3.5.1 表5显示，在10×40倍镜下，通过显微形态学计算机网络系统测量股骨头骨小梁密度，每张切片取5个视野，取其平均值。

表5 壮骨止痛方水提B部位对去势骨质疏松模型雌鼠左股骨骨小梁密度的影响

表5提示，壮骨止痛方水提B部位能够显著提高去势骨质疏松模型雌鼠左股骨骨小梁密度，与模型组比较有非常显著的差异性(P<0.01)，疗效不及壮骨止痛方。

3.5.2 电镜检查 JEOL-1230型透射电镜观察、照片。

结果分析，假手术组骨间质致密，骨细胞内部分线粒体存在空泡变性，骨陷窝较小。模型组大部分骨细胞胞核及胞浆浓缩明显，骨细胞的凸起明显减少，骨陷窝椭圆形。给药后，水提B部位组骨细胞核较正常，胞浆浓缩明显，骨细胞的凸起明显减少，骨陷窝呈扁椭圆形。壮骨止痛方组骨细胞较正常，骨细胞凸起无明显改变，骨陷窝明显缩小呈扁椭圆形。

4 讨论

壮骨止痛方水提B部位是淫羊藿等的水提取物。现代药理研究证明，淫羊藿有增强下丘脑-垂体-性腺轴及肾上腺皮质轴、胸腺轴等内分泌系统的激素样作用，能促进骨髓细胞DNA合成，促进组织蛋白质合成及促进骨细胞生长等作用，对破骨细胞有直接的抑制作用，因而能对抗动物去卵巢、去睾丸及长期大剂量服用肾上腺皮质激素所引起的骨质疏松症。有促进骨形成防止骨丢失，升高骨密度，改善骨生物力学性能和骨小梁形态结构的作用。有文献报道，淫羊藿水提液能够促进骨髓基质中的成骨细胞表达 TGF-B1，并抑制 TNF-α的表达，间接抑制骨吸收[2];可抑制骨髓细胞诱导破骨细胞的形成，从而减少破骨细胞的产生。淫羊藿可能通过下调这些骨调节相关细胞因子，抑制破骨细胞的形成，而淫羊藿同时还能够直接促进破骨细胞的凋亡[3]。在淫羊藿作用下，破骨细胞的生成、分化成熟受阻及凋亡增加，最终阻止了由雌激素水平下降引起的骨代谢失衡，维持了骨质中的骨量和骨小梁的形态，防止了骨质疏松症的发生[4]。

本实验中，与假手术组和空白组比较，模型鼠股骨和腰椎骨密度都明显下降，差异有显著或非常显著意义(P<0.05或 P<0.01);血清 E2含量明显下降(P<0.01);骨小梁稀疏、破坏，骨髓腔扩大，梁髓比明显下降，说明绝经后骨质疏松症病理模型复制成功。给药后与模型组比较，水提B部位组骨密度增加非常明显，骨生物力学性能提高，骨小梁密度分布比较均匀，梁髓比基本恢复正常，镜下可见成骨细胞，说明壮骨止痛方水提B部位对骨质疏松症有良好疗效。与空白组和假手术组比较，模型组血清BGP、PTH均明显升高(P<0.01)，血清CT也有升高的趋势，血清E2含量明显下降(P<0.01)，表明去势后模型鼠雌激素缺乏或不足，骨转换加快，导致高转换型骨质疏松发生。与模型组比较，水提B部位能够显著降低去势骨质疏松模型雌鼠血清CT(P<0.05)，说明水提B部位能够降低骨转换，有升高去势骨质疏松模型雌鼠血清E2的趋势，但无差异性(P>0.05)。BGP是成骨细胞的特异性产物。壮骨止痛方水提B部位组血清BGP、PTH含量高于模型组，血清CT含量明显降低，提示壮骨止痛方水提B部位能提高成骨细胞活性，促进骨形成，抑制骨吸收。

综上所述，壮骨止痛方水提B部位能显著增加模型鼠骨密度，提高模型鼠骨生物力学性能，逆转骨质疏松症的病理形态学改变，有效治疗骨质疏松症。其机理可能是增强下丘脑-垂体-性腺轴及肾上腺皮质轴、胸腺轴等内分泌系统的激素样作用，促进骨髓细胞DNA合成和组织蛋白质合成，提高成骨细胞活性，促进骨形成;促进骨髓基质中的成骨细胞表达TGF-B1，并抑制 TNF-α的表达，间接抑制骨吸收。抑制骨髓细胞诱导破骨细胞的形成，从而减少破骨细胞的产生，通过下调这些骨调节相关细胞因子，抑制破骨细胞的形成，同时直接促进破骨细胞的凋亡。

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[2]叶纯，苏进，王凡，等.淫羊藿影响去势大鼠椎骨微环境中TNF-α、TGF-β1 表达的研究[J].中国临床解剖学杂志，2006，24(6):687-690.

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[4]叶纯，苏进，王凡，等.淫羊藿水提液对去势大鼠松质骨的影响[J].中国临床解剖学杂志，2008，26(1):87-90.