柚皮素对炎性气道黏液高分泌的抑制作用

杨 娟，周向东

(重庆医科大学第二附属医院呼吸内科，重庆 400010)

气道黏液高分泌是慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张症等慢性炎症性疾病的重要临床病理特征，也已成为影响COPD病情和预后的独立危险因素[1]。氧化应激是启动和加重炎症反应的重要因素，其主要物质活性氧(ROS)已被证实是一种强化学介质，能作用于细胞膜的受体激酶，调节多种信号转导途径，并参与黏液高分泌过程[2]，但具体途径尚未完全明了。表皮生长因子受体(EGFR)作为一种酪氨酸激酶受体，与气道黏蛋白的表达有密切联系[3]。有研究指出，过量的 ROS可上调 EGFR的表达水平和增加其磷酸化水平，调控EGFR信号级联及后续细胞分子效应[4]。柚皮素是一种广泛用于植物和中药中的黄酮类化合物，国外研究证实，除具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤及降血脂的作用，还具有较强的抗氧化瘤及降血脂的作用，还具有较强的抗氧化作用，能作用于细胞信号转导途径并发挥其生物学效应。本研究旨在探讨柚皮素对黏液高分泌的影响及其在ROS/EGFR细胞信号通路中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 柚皮素纯度大于95%购于美国sigma公司，取其粉末溶解于20%的二甲基亚砜中，加不含血清的培养液稀释为 400mmol/L，采用0.02μm微孔过滤器除菌、分装，滤器除菌、分装，避光－20℃冰箱保存，2个月内有效，使用前以培养液稀释至所需浓度(100μmol/L)，二甲亚砜的终浓度<0.1%。

1.1.2 细胞来源 人肺上皮细胞株A549(中国科学院上海细胞研究所)培养于含10%小牛血清、双抗(青霉素 100U/ml、链霉素 100U/ml)的RPMI1640培养基中，置37℃ 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代，每2d传代1次并随时观察细胞形态。

1.1.3 主要试剂 人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)购自美国 EPC公司，Triton-X100为美国sigma公司，活性氧清除剂 DMTU购自美国Calbiochem公司，小鼠抗人黏蛋白(MUC)5AC单克隆抗体为美国Chemicon公司，兔抗EGFR多克隆抗体、小鼠抗磷酸化EGFR(P-EGFR)单克隆抗体为美国Cell Signaling公司，异硫氰酸(FITC)标记的羊抗鼠荧光素IgG、辣根酶标记羊抗兔 IgG、辣根酶标记的羊抗鼠IgG为北京中衫金桥生物技术有限公司，RNA抽提试剂盒、逆转录(RT)-PCR试剂盒为大连宝生物工程有限公司，MUC5AC、EGFR、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物由上海生物有限公司合成，活性氧试剂盒、免疫细胞沉淀裂解液为碧云天生物技术研究所，其余试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞活性测定 将细胞接种于96孔板，每孔200μl细胞悬液中含1×104个细胞，培养24h后换无血清培养液维持24h，分别加入浓度为0、20、50、80、100、200、400μmol/L 的柚皮素，作用24h后行甲基偶氮唑盐(MTT)法测定，酶标读数仪上以492nm波长测定各孔吸光度(A)值。不加柚皮素只加等量二甲基亚砜孔为阴性对照，无细胞仅加培养液孔为空白对照。各实验组安排6个复孔取平均值，细胞存活率=(实验组值A值－空白对照组A值)/(阴性对照组 A值 －空白对照组 A值)×100%。实验重复3次，结果基本一致，以其中1次实验值为准，绘制细胞生存图。

1.2.2 细胞处理及分组 细胞贴壁融合达70%～80%时传代培养。用于RT-PCR检测的细胞组接种于6孔板，每孔接种4×105个细胞，用于提取蛋白的接种于50ml培养瓶，每瓶接种20×105个细胞。当细胞融合约为70%时更换无血清培养基(用0.1%牛血清白蛋白代替血清)继续培养24h，以维持基础浓度的黏蛋白表达。分组:(1)对照组:无血清培养基培养;(2)处理组:无血清培养基中加入终浓度为50nmol/L的HNE;(3)柚皮素组:加入终浓度为100μmol/L的柚皮素，作用24h后再给予终浓度为50nmol/L的 HNE刺激;(4)DMTU组:先给予20μmol/L的DMTU处理，30min后，再给予终浓度为50nmol/L的HNE刺激;(5)柚皮素+DMTU组:先加柚皮素100μmol/L作用24h后，再给予20μmol/L的DMTU处理30min后，最后给予终浓度为50nmol/L的HNE刺激。各组处理24h内取样实验。

1.2.3 细胞中ROS含量的测定 处于对数生长期的A549细胞以无血清培养基维持24 h，洗涤换液，分别加入终浓度5nmol/L、25nmol/L、50nmol/L HNE和100μmol/L柚皮素无血清培养液孵育，对照组仅以无血清培养液维持培养。24h后测定各组细胞中ROS的相对含量，按试剂盒操作说明进行活性氧的测定，结果以吸光度A值表示。

1.2.4 RT-PCR检测EGFR mRNA和MUC5AC mRNA的表达水平 分别提取各组细胞的总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并测定样品A260/A280比值和浓度，确保比值介于1.8～2.0，总RNA提取后保存于－80℃冰箱，并于数日内尽快使用。

两步法进行RT-PCR。扩增引物序列:EGFR上游引物5′-CTC-ACG-CAG-TTG-GGC-ACT-TT-3′，EGFR 下游引物:5′-TCA-TGG-GCA-GCT-CCT-TCAGT-3′，扩增长度为 301bp;MUC5AC 上游引物:5′-TCA-ACG-GAG-ACT-GCG-AGT-ACA-C-3′，下 游 引物:5′-TCT-TGA-TGG-CCT-TGG-AGC-A-3′，扩增长度为 135bp;逆转录反应条件为 30℃、10min，42℃30min，95℃ 5min，5℃ 5min，以上步骤 1 个循环。MUC5AC+EGFR的PCR反应条件为:于94℃预变性2min终止后，紧随30个循环，循环参数:94℃变性 30s，59℃ 退火 30s，72℃ 延伸 1.5min，后 72℃延伸5min补齐末端。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，图像采集后用Bandleader软件进行吸光度面积积分分析，以与GAPDH mRNA的比值作为目的基因mRNA的相对含量。

1.2.5 Western blot法检测各目标蛋白的表达

使用细胞裂解液冰上操作，提取各组培养瓶的总蛋白后加入5倍十二烷基硫酸钠(SDS)，经高温加热使蛋白完全变性、解聚，－80℃冰箱保存备用。各样品上样量为30μl，8%或12%SDS-PAGE凝胶恒压电泳，浓缩胶80V，分离胶100V，给予聚偏二氟乙烯膜转膜，恒流250mA转膜，EGFR和P-EGFR转膜1h 50min，脱脂奶粉封闭 1h，加入一抗 4℃孵育过夜，一抗:1∶200的小鼠抗 P-EGFR单克隆抗体、兔抗EGFR多克隆抗体;PBST洗膜15min，加入二抗孵育1h，二抗1∶2000的辣根酶标记羊抗兔 IgG，辣根酶标记的羊抗鼠 IgG。用增敏化学发光法显影后，目标条带经吸光度面积积分析，以与 β-肌动蛋白产物条带的比值作为相对含量。

1.2.6 激光共聚焦显微镜观察不同条件下MUC5AC蛋白表达的变化 将对数生长期A549细胞消化后，接种于载有盖玻片的24孔培养板中，每孔接种1×105个细胞，24h后更换无血清培养基，培养24h后再分组培养。细胞培养结束后吸弃培养液，用0.01mmol/L的PBS漂洗，用4%多聚甲醛在室温下固定30min，用0.4%Triton-X100在室温下作用20min，加入羊血清工作液在室温下封闭30min;去血清加入一抗(小鼠抗人MUC5AC单克隆抗体1∶500)置湿盒内4℃过夜，0.01mmol/L的 PBS漂洗;加二抗(FITC标记的羊抗鼠IgG1∶100)，置湿盒内室温下 2h，0.01mmol/L的 PBS漂洗，滴加5mg/L碘化丙锭，室温下5min 50%甘油封片;未加一抗仅加二抗者作为阴性对照，激光共聚焦显微镜观察并成像。

1.2.7 酶联免疫吸附法测定细胞裂解液中MUC5AC蛋白含量 培养瓶内细胞在冰上用0.01mmol/L的PBS清洗，加入冰预冷的RIPA裂解液及相应1/100量的苯甲基磺酰氟化物，晃动、吹打后吸入 EP管中冰浴 20min，4℃ 15000r/min离心20min，留上清液。取各样本少许采用二喹啉甲酸法测定总蛋白含量，用RIPA裂解液调整蛋白浓度使各样本一致，再用 PBS稀释蛋白样本。取各样本100μl包被96孔酶标板，置湿盒中4℃过夜。次日弃包被液，扣干后每孔加入200μl的1%牛血清白蛋白，于湿盒中37℃封闭1h。洗板后每孔加入1∶1000小鼠抗人 MUC5AC单克隆抗体 50μl，37℃孵育1h。洗板后扣干，四甲基联苯胺过氧化物酶溶液显色，终止反应后测各孔在450nm处 A值，与标准品比较计算MUC5AC含量。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.0软件包对结果进行统计学分析，所有数据均以±s表示，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞活性测定结果

柚皮素浓度分别为 0、20、50、80、100、200 和400μmol/L时，细胞生存率分别为100% ±1.0%、98.2% ±0.2%、92.9% ±0.7%、84.6% ±0.3%和81.6% ±0.6%，表明柚皮素浓度低于 100μmol/L时对细胞无明显损伤，随着浓度递增，当柚皮素浓度达200μmol/L和400μmol/L时细胞贴壁能力降低，死亡细胞增多，细胞生存率分别为45.0% ±0.8%和25.4%±0.7%。

2.2 细胞中ROS的相对含量

在5nmol/L、25nmol/L和50nmol/L的HNE刺激后的细胞中，ROS的相对含量分别为0.68±0.02、0.81±0.07和 0.98±0.08，说明随着 HNE 浓度增加，ROS的含量逐渐增加，与对照组(0.39±0.06)比较，t值分别为 11.19、11.20和 11.43，50nmol/L的HNE和柚皮素预处理组(0.57±0.04)比较t值为11.23，均P<0.01，差异均有统计意义，且表明柚皮素具有抑制细胞内ROS产生的作用。

2.3 各组指标mRNA及蛋白的表达

表1显示，MUC5AC、EGFRmRNA和 EGFR、PEGFR蛋白的表达吸光度面积积分值。

表1 各组指标mRNA和蛋白表达的吸光度面积积分值比较

表1 各组指标mRNA和蛋白表达的吸光度面积积分值比较

注:HNE:人中性粒细胞弹性蛋白酶;DMTU:活性氧清除剂;MUC5AC:黏蛋白5AC;EGFR:表皮生长因子受体。▲以MUC5AC/总蛋白(μg/mg)表示。与对照组比较:＊＊P<0.01;与HNE组比较:△△P<0.01;与柚皮素组和DMTU组比较:##P<0.05

组 别n mRNA蛋白MUC5AC EGFR MUC5AC▲EGFR P-EGFR对照组 3 0.70±0.02 0.73±0.01 112±4 0.39±0.03 0.38±0.02 HNE 3 0.92 ±0.08＊＊ 0.91 ±0.05＊＊ 152 ±6＊＊ 0.86 ±0.03＊＊ 0.93 ±0.05＊＊柚皮素 3 0.57±0.09△△ 0.54±0.07△△ 125±6△△ 0.52±0.05△△ 0.61±0.01△△DMTU 3 0.62±0.06△△ 0.63±0.03△△ 128±4△△ 0.53±0.02△△ 0.74±0.05△△柚皮素 +DMTU 3 0.34±0.04## 0.38±0.03## 113±2## 0.42±0.02## 0.41±0.03##

表1显示，与对照组相比，给予 HNE刺激后MUC5AC mRNA、EGFR mRNA 和 EGFR、P-EGFR 蛋白表达增强(P<0.01)，而给予柚皮素和 DMTU预处理后表达减弱，柚皮素组与 HNE组比较 P<0.01;DMTU组与 HNE组比较 P<0.01;柚皮素 +DMTU组分别与柚皮素组和DMTU组比较，以上指标表达进一步降低(P<0.05)。

2.4 HNE刺激前后和柚皮素预处理后A549细胞MUC5AC的激光共聚焦显像

经异硫氰酸荧光素/碘化丙锭染色的高倍放大镜结果显示，图A中未加一抗的阴性对照组A549细胞仅可见呈红色显色少量的 MUC5AC;图 B中A549细胞的MUC5AC蛋白主要定位于细胞质，呈绿色显色;图 C中 A549细胞经 HNE处理后MUC5AC的表达较 A549细胞明显增多;图 D中经柚皮素处理后A549细胞在胞质的表达减少。

图1 A549细胞黏蛋白表达(激光共聚焦显微镜×400)

3 讨论

黏液高分泌是影响慢性气道炎症发生、发展及预后的重要因素。目前认为，HNE除了是参与急性肺损伤的主要因素外，还是黏蛋白表达的最强诱导物，也是炎症反应时气道黏液高分泌形成过程的主要刺激因子，而MUC5AC则为炎症反应气道黏蛋白的主要特征性表型，并决定着高分泌黏液的病理特征[5]。

EGFR通过配体依赖和非配体依赖机制而自身磷酸化，引发下游信号级联反应，并传递至细胞核而活化相应的顺式反应元件，启动黏蛋白合成。有研究表明，多种刺激因子均可借配体依赖途径激活EGFR信号级联通路引起黏蛋白合成增加[6]。气道炎症时出现中性粒细胞大量聚集，可释放HNE并刺激局部释放多量ROS。以往的研究提示，ROS可通过激活 EGFR的配体释放而间接激活 EGFR[7];而最近的研究也表明，ROS还可通过非配体依赖机制直接反相激活EGFR。通过减少EGFR表达和活化的刺激来抑制黏液高分泌，可能是治疗气道黏液高分泌的有效靶点，而ROS由于兼具双重刺激机制成为重要靶目标。

柚皮素是柚油的主要成分，主要来源于未成熟的柚子皮，具有抑制氧化产物的产生和增强抗氧化物酶活性的作用[8]。本研究首先以 HNE为刺激因素，检验其是否可诱导人肺腺癌细胞A549产生大量的ROS，引起EGFR磷酸化水平增高，上调气道上皮细胞黏蛋白的表达。结果表明，A549细胞经HNE处理后，细胞内 ROS含量增加，其 MUC5AC mRNA及MUC5AC蛋白含量也增加，且EGFR和PEGFR也明显增加，说明黏蛋白的增加与 EGFR的活化呈正相关，这与MUC5AC合成受EGFR信号通路调控的研究结果一致。当给予柚皮素干预后，通过活性氧试剂盒测定人 A549细胞内ROS水平降低，RT-PCR测定 EGFR mRNA和 MUC5AC mRNA均较HNE刺激组明显下调。Western blot法检测结果表明，相应的EGFR和P-EGFR蛋白表达明显降低;细胞免疫组织化学结果也表明，经柚皮素预处理后MUC5AC蛋白表达减少;激光共聚焦观察结果也显示，柚皮素处理后A549细胞质中 MUC5AC蛋白表达减弱，提示柚皮素可抑制 ROS的产生而引起EGFR的表达下调及其磷酸化水平降低来减少黏蛋白的转录和合成。此外还观察到，柚皮素+DMTU组EGFR mRNA和其蛋白以及MUC5AC的表达比单用DMTU组要低，提示柚皮素可通过直接降低EGFR膜受体水平和阻断EGFR磷酸化来进一步降低黏蛋白的转录和合成。本实验结果证实，柚皮素对黏液高分泌的主要发生途径有明显的抑制作用，这为柚皮素的药用开发提供了理论依据。

综上所述，柚皮素可明显改善炎性刺激所致的气道黏液高分泌状态，其机制主要系通过抑制ROS的产生、降低EGFR膜受体水平和阻断EGFR磷酸化来实现的。柚皮素这一效应，显示了对肺部炎性疾病发生、发展的有益作用，加之其资源丰富、成本低廉，具有一定的开发价值。

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