补肾健脾活血方对大鼠骨质疏松骨折愈合的作用及其机理探讨＊

潘贵超，王辉奇，张治国

(1.北京昌平区华一医院，北京 102208;2.中国中医科学院望京医院，北京 100102;3.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

随着世界人口的老龄化，骨质疏松骨折已成为临床的常见病、多发病，合并严重并发症，严重危害人们的生存质量。中药治疗骨质疏松及骨折历史悠久，疗效确切，是目前治疗骨质疏松及骨折的主要手段之一。本研究拟从基因水平探讨补肾健脾活血方对骨折愈合的作用及其机理，为采用该方治疗骨质疏松骨折提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 动物 本实验研究对象为清洁级8月龄健康Sprague Dawley(SD)雌性大鼠180只，体重250g～280g，中国医学科学院实验动物研究所提供，在天津中医药大学动物实验室饲养，动物许可证号SCXK(京)2005-0013。

1.1.2 主要药物与试剂 本实验所用中药均由北京同仁堂公司提供，中药方剂委托天津中医药大学附属医院制剂室制成含生药5g·ml-1的浓缩口服液，灭菌后装瓶冷藏备用。阳性对照药采用贵州同济堂制药有限公司生产的仙灵骨葆胶囊，批号20080607。青霉素由华北制药厂生产，160万单位，批号 20080204。TGF-βmRNA ISH DIG KIT，复合消化液(T/P/E，Ph6.4)由天津市灏洋生物制品科技有限责任公司提供。DAB显色试剂盒由福州市迈新生物技术开发有限公司提供。

1.1.3 主要仪器 全自动病理切片包埋机(EG1160)，德国莱卡;图像分析软件:ImagePro Plus 5.0。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 麻醉后，去势组(OVX)进行双侧卵巢切除手术后12周，在腹腔麻醉下行大鼠股骨下端上2cm处切开手术刀切断术，并行骨圆针逆行穿针术固定。

1.2.2 分组方法 用SPSS软件产生随机数字的方法将140只大鼠随机分为3组:正常组10只和骨质疏松组(OVX)130只。3个月后处死正常组及骨质疏松组各10只，测骨密度观察模型复制情况。造模成功后再将骨质疏松组120只大鼠分为阳性对照组(仙灵骨葆胶囊)、模型组、补肾健脾活血组，每组40只，每组再随机分为5个小组，每组8只大鼠。通过观察补肾健脾活血组与模型组影响TGF-βmRNA表达情况来分析补肾健脾活血治疗与模型组TGF-βmRNA表达不同。补肾健脾活血组与阳性药物组TGF-βmRNA表达阳性比较补肾健脾活血治疗与单纯补肾治疗促进TGF-βmRNA表达不同。

1.2.3 给药方法 补肾健脾活血中药药液按剂量5 g/(kg·d)灌胃，根据大鼠对人等效剂量的2倍每日早晚2次灌胃。阳性药物对照组给予仙灵骨葆胶囊水溶液灌胃5 g/(kg·d)，空白对照组与模型组给予等量蒸馏水灌胃。所选用实验用方来源著名骨伤科专家刘柏龄教授经验方:淫羊藿、熟地、鹿角霜、申姜、肉苁蓉、败龟板、生黄芪、鹿衔草、鸡血藤、全当归、川杜仲、汉三七、广陈皮、淮山药、鹿角胶(烊化)、莱菔子。

1.2.4 标本处理 术后第 7、14、28、42、56天每个实验组随机抽取8只大鼠用拉颈法处死，取出股骨置于质量分数为40g·L－1的多聚甲醛(含1‰DEPC)4℃下固定24 h。取右侧股骨标本为研究对象，以骨折为中心取长约10 mm的骨段，将其置于质量分数为 10%的 EDTA-Na2(含 1‰DEPC)脱钙(每4 d更换1次脱钙液)。待骨质松软，针刺及刀割无明显阻力后表示脱钙完成。

1.2.5 HE染色 根据HE染色有关试剂的使用说明及该病理科的操作技术规范进行染色。

1.2.6 原位杂交 采用天津市灏洋生物制品科技有限责任公司生产的TGF-β(mRNA)ISH DIG KIT原位杂交试剂盒，对骨折标本 TGF-βmRNA表达进行原位杂交检查。

1.2.7 图像分析 以骨折中心在两断端附近相同位置对骨折端骨干细胞、骨外膜、骨内膜、血肿、纤维骨痂、软骨骨痂、骨小梁、小梁间组织及骨髓腔组织各取2个高倍镜视野。用Imagepro Plus 5.0图像分析软件，对这9种组织阳性反应细胞的平均光密度值(MOD)进行分析。

1.2.8 统计学处理 用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析，结果采用均数±标准差表示，检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 补肾健脾活血方对骨质疏松骨折大鼠愈合过程组织形态学的影响

骨折后7d，断端间为血肿及其机化后的纤维素，有单核细胞浸润。缺损区内可见大量血肿细胞和炎性细胞。骨折后14d:所有标本的外骨膜均增厚，部分标本外骨膜增厚超过4层，少数标本外骨膜成骨细胞显著增生，增生细胞融合成一片，骨基质沉着，形成类骨质、软骨及骨小梁;所有标本骨内膜增厚，大部分标本骨髓腔内有新生骨小梁生成，部分标本新生骨小梁充满骨髓腔。骨折后28d，绝大多数标本骨折断端成纤维细胞和纤维组织及类骨质增多，所有标本外骨膜成骨细胞显著增生，增生细胞融合成一片，骨基质沉着，形成骨样组织、软骨及骨小梁。骨折56d后，编织骨形成，骨髓腔内的骨小梁变细，骨髓腔再通，编织骨逐渐向板层骨转变。

2.2 补肾健脾活血方对骨质疏松骨折大鼠愈合过程中TGF-βmRNA表达的影响

术后7 d，补肾健脾活血组、阳性对照组显著高于模型组(P<0.01)，补肾健脾活血组与阳性对照组无明显差异。术后14d，补肾健脾活血组与阳性对照组有显著差异(P<0.05)。术后28d，补肾健脾活血组与模型组有显著差异(P<0.01)，补肾健脾活血组显著高于阳性对照组(P<0.05)。术后42d，补肾健脾活血组与模型组有显著差异(P<0.05)，其他各组无差别。术后56d，补肾健脾活血组、阳性对照组显著高于模型组(P<0.01)，补肾健脾活血组与阳性对照组有显著差异(P<0.05);各组总平均值:补肾健脾活血组极显著高于模型组，阳性对照组极显著高于模型组(P<0.01)。

表 模型组、阳性对照组及补肾健脾活血组骨折愈合过程中TGF-βmRNA表达MOD值变化

表 模型组、阳性对照组及补肾健脾活血组骨折愈合过程中TGF-βmRNA表达MOD值变化

注:与模型组比较:*P<0.05，＊＊P<0.01;与阳性对照组比较:＆P<0.05，＆＆P<0.01

天 数 模型组 阳性对照组 补肾健脾活血组0.204±0.015 0.220±0.008＊＊ 0.225±0.011＊＊第 7天第14天 0.206±0.010 0.218±0.007* 0.233±0.009＊＊＆第28天 0.220±0.01 0.228±0.010 0.241±0.004＊＊＆第42天 0.219±0.010 0.229±0.008 0.229±0.006*第56天 0.203±0.009 0.225±0.007＊＊ 0.235±0.010＊＊＆平 均 值 0.210±0.013 0.224±0.009＊＊ 0.233±0.010＊＊＆＆

3 讨论

中医学无“骨质疏松症”这一病名，但历代中医文献的记载中“骨痿”、“骨枯”、“骨痹”的描述与OP的临床症状颇似。中医学认为，肾虚是本病的主要病因，脾虚是本病的重要病机，肝血不足、气滞血瘀是本病的促进因素，所选用实验用方来源于著名骨伤科专家刘柏龄教授经验方。补肾健脾活血法以“肾主骨”理论为指导，针对骨质疏松症“多虚多瘀”的病机特点，以申姜、肉苁蓉补肾壮骨为主，辅之鹿角胶、淫羊藿、川杜仲补肾益精、强筋骨为臣，同时配以黄芪补中益气，当归、鸡血藤、三七活血止痛，广陈皮、淮山药、熟地、败龟板滋阴益气共为佐药，此既培补后天生化之源以充肾精，又达到补中寓通、补而不滞的目的。本方具有补肾壮骨、活血通络、健脾益气滋阴的作用，组方上既强调补益又突出调节，补肾的同时注重祛瘀，体现出中医学治疗疾病的整体观念和“标本兼治”的思想。

现代医学研究证实，骨折愈合的实质是骨细胞再生，骨折完全性修复，其整个过程受局部骨生长因子的调控。大量实验及临床研究初步证实，骨折局部骨细胞生长因子对于成骨的诱导、细胞的分裂增殖、细胞的分化成熟、骨基质的合成与软骨内化骨及局部血液循环的重建等起着极其重要的作用，调控着骨折的再生修复过程。TGF-β可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化，促进成骨细胞的增殖，刺激Ⅱ型胶原、骨连接素和骨桥蛋白的合成，同时 TGF-β可抑制破骨细胞的生成以及成熟破骨细胞的活性，从而抑制骨吸收的作用，所以TGF-β在骨组织代谢过程中起着十分重要的作用[1～3]。

骨折后7 d，断端间为血肿及其机化后的纤维素有单核细胞浸润，缺损区内聚集大量血肿细胞和炎性细胞。骨折后14d，所有标本的外骨膜均增厚，可见大量间充质细胞、成骨细胞与新形成的骨细胞。骨折后28d，绝大多数标本骨折断端成纤维细胞和纤维组织及类骨质增多，所有标本外骨膜成骨细胞显著增生，增生细胞融合成一片，骨基质沉着，形成骨样组织、软骨及骨小梁，在成纤维细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞等表达阳性。补肾健脾活血方主要促进了大鼠骨折愈合过程中软骨骨痂向骨性骨痂转化，提高了骨的强度，促进了骨折愈合。

从骨折愈合整个时间点看，骨折后7d～56d，补肾健脾活血组极显著高于模型组和阳性对照组，阳性对照组极显著高于模型组，说明从骨转化和成纤维方面说明补肾健脾活血组能促进断端TGF-βmRNA表达的作用最强，显著提高TGF-βmRNA表达峰值水平。通过与阳性药物组对比，说明根据骨质疏松的病机辨证组方比单纯补肾更能显著提高TGF-βmRNA表达峰值水平，说明通过促进断端成纤维细胞、成骨细胞等 TGF-βmRNA表达可能是中药促进骨质疏松性骨折愈合的机制之一。补肾健脾活血方治疗效果最好，说明辨证治疗是必要的。

[1]孙玉鹏，胡蕴玉.β转化生长因子研究进展[J].中华骨科杂志，2007，14:505.

[2]孙玉鹏，陆裕补，胡蕴玉，等.TGF-β提取纯化及其诱导小鼠股骨成骨作用[J].中华骨科杂志，1995，15:610.

[3]Centrella M， Skeletaltissueand transforming growth factor FASEBI[J]，2008，2(1)3066-3073.