雷公藤多苷对正常及佐剂关节炎大鼠睾丸组织形态结构、NOS表达影响的比较研究＊

李 健，谭 勇，吕永恒，何小鹃，鞠大宏，吕爱平△

(1.北京中医药大学基础医学院人体形态系，北京 100029;2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700;3.天津市南开理疗医院，天津 300100;4.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglycoside，GTW)是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)临床治疗的“二线”首选药物，但其明确的生殖毒性在很大程度上限制了该药的临床应用[1、2]。有中药学专家指出，中药的毒副作用是随着机体状态或疾病状态而变化的。一些中药可能对正常生理状态的机体有毒副作用，而可能对病理状态的机体没有或仅出现轻微的毒副作用[3、4]。为了证明上述观点，本研究以正常雄性SD大鼠(健康状态)及弗氏完全佐剂诱导的类风湿性关节炎大鼠(发病状态)为研究对象，比较观察了GTW对2种不同机能状态大鼠睾丸组织形态结构及NOS表达的影响，以期为针对中医证候的中药毒性评价思路提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

大鼠NOS检测试剂盒T-NOS(A014-2)购自南京建成生物工程研究所，雷公藤多苷片购自江苏美通制药有限公司(生产批号080717)，弗氏完全佐剂购自美国Sigma公司，NOS一抗购自美国Santa Cruz生物公司(Sc-58399)，其他试剂及相关实验耗材购自北京中杉金桥生物公司。

1.2 动物及处置方法

雄性SD大鼠100只160g±20g，购于军事医学科学院，合格证号 SCXK-军-2007-004。动物随机分为正常组(40只)和AA组(60只)2组。AA大鼠的制备方法按照本课题组的常规方法进行[5]，2周后根据关节炎评分量表筛选得到病理特征明显的AA大鼠40只组成AA发病组。正常及AA大鼠各自随机分成4组(每组10只):溶剂对照组(生理盐水)、GTW低剂量组(7mg/kg体重)、GTW中剂量组(70mg/kg体重)和 GTW高剂量组(105mg/kg体重)，灌胃给药(1次/d，连续2周)。给药剂量按人临床常用量换算(大鼠系数为7)。

1.3 睾丸及附睾系数测定

准确称量大鼠体重及睾丸、附睾的重量，计算脏器、体重的比值。

1.4 睾丸组织匀浆T-NOS测定

准确称取大鼠睾丸组织，组织匀浆器匀浆，3000rpm离心10min，取上清，化学比色法测定上清中T-NOS的含量，具体实验步骤参照试剂说明书。

1.5 睾丸组织石蜡切片HE染色

睾丸组织经4%多聚甲醛固定后行常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及 HE染色，光镜观察并摄片。

1.6 睾丸组织冰冻切片NOS免疫组化显色

睾丸组织经OCT包埋、冰冻切片、S-P法免疫组化染色、DAB显色、苏木素轻度复染，光镜观察、摄片。

1.7 数据统计学分析

组内数据采用单因素方差分析，组间比较采用广义线性模型两因素方差分析，数据以均值±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AA大鼠模型的评价

AA模型制备的结果与本课题组前期实验完全符合，具有高度重复性[5]。图1显示，佐剂注射1 d后，致炎侧关节明显红肿，随时间延长肿胀程度加剧;继发侧自佐剂注射后3周肿胀明显并呈缓慢增高的趋势，表明佐剂性关节炎模型制备成功。

图1 弗氏完全佐剂诱导SD大鼠关节肿胀的变化趋势(n=10)

2.2 GTW对睾丸及附睾系数的影响

各组大鼠体重及睾丸、附睾重量经精确称量。图2显示，与溶剂对照组比较，GTW高剂量处理大鼠睾丸系数均呈显著减小的趋势(P<0.01)，而各组附睾系数没有显著性差异(P>0.05)。多元分析结果表明，正常组与AA发病组比较，睾丸及附睾系数均无显著性差异(P>0.05)。

2.3 GTW对大鼠睾丸组织形态结构的影响

图3显示，正常组溶剂对照大鼠睾丸组织着色均匀，生精小管结构清晰，各级生精细胞排布规律，精子细胞及精子数量较多。与之比较，GTW低剂量处理大鼠睾丸组织没有明显的病理改变;GTW中、高剂量处理大鼠睾丸生精小管的生精上皮明显变薄，细胞层次紊乱，部分生精细胞肿胀或空泡化，精子细胞及精子数量明显减少。图4显示，与之比较，AA发病组中只有GTW高剂量处理大鼠睾丸组织出现较明显病理改变外，其他各组大鼠睾丸组织形态结构均正常，没有明显的病理变化。

图2 各组大鼠附睾系数(A)及睾丸系数(B)统计结果(n=10)

图3 不同剂量GTW对正常大鼠睾丸组织形态结构的影响，HE染色，×100

图4 不同剂量GTW对AA大鼠睾丸组织形态结构的影响(HE染色×100)

2.4 睾丸组织中T-NOS含量测定

与正常组溶剂对照大鼠比较，GTW高剂量处理大鼠睾丸组织中T-NOS含量显著减少(P<0.05);与AA发病组溶剂对照大鼠比较，GTW低剂量处理大鼠睾丸组织中T-NOS含量显著增加(P<0.05)。多元统计分析结果表明，AA发病组大鼠睾丸组织中T-NOS含量显著高于正常组大鼠(P<0.05，图5)。NOS抗体免疫组织化学显色结果显示:正常对照大鼠睾丸组织中NOS阳性反应明显，阳性细胞较多(图6-E);与之比较，GTW处理大鼠睾丸组织中NOS阳性反应减弱，阳性细胞减少(图6-F)。AA发病组溶剂对照大鼠睾丸组织 NOS呈高表达(图6-e);与之比较，GTW处理大鼠睾丸组织NOS亦呈强阳性(图6-f)。

图5 不同剂量GTW对正常大鼠及AA大鼠睾丸组织总NOS水平的影响(n=10)

图6 睾丸组织冰冻切片pananti-NOS免疫组化(DAB显色，×100)

3 讨论

雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglycoside，GTW)中含有多种生物活性组分，如生物碱、二萜、三萜类等多种化学组分，具有祛风除湿、消肿、舒筋通络等功效。上世纪80年代，雷公藤多苷被开发为中成药(雷公藤多苷片)进入临床，主要用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、系统红斑狼疮、强直性脊柱炎、原发或继发性肾小球肾炎、哮喘等免疫相关性疾病。GTW治疗RA的初步药理机制是通过抗炎和免疫抑制作用，纠正T细胞亚群分布紊乱及多种炎症介质释放[1]。然而，GTW在临床使用的过程中也伴随着不同程度的毒副作用，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻、肝功能异常及生殖毒性等[2]。动物实验证实[6、7]，GTW能显著抑制精子细胞及精子的形成，抑制睾丸组织中一氧化氮合酶(NOS)的合成，进而影响NO的生成和调控，导致精子发生受阻或发育停滞。为此，探讨GTW毒副作用与机体病理生理状态等因素的关系，了解其毒副作用形成的特点及规律是该药临床应用及二次开发的关键问题。

事实上，雷公藤抗男性生育的作用早为人知(计划生育专家拟将其开发为男性避孕药)，是该药毒副作用研究不可回避的问题。本实验比较观察了高、中、低3个剂量GTW对正常生理状态及佐剂诱导的关节炎病理状态大鼠睾丸组织形态结构及NOS表达的影响。结果表明，GTW对2组大鼠的睾丸及附睾系数没有影响。GTW低剂量(临床等效剂量)对2组动物睾丸组织形态结构均无显著影响;GTW中剂量(约临床用量10倍)可导致正常大鼠睾丸组织生精上皮细胞层次紊乱和细胞肿胀，然而该剂量对关节炎发病状态大鼠睾丸组织形态结构并无明显影响。若用高剂量(约临床用量的15倍)处理动物，正常及AA发病组大鼠睾丸组织形态结构均有明显改变，生精小管萎缩、生精上皮变薄、精子细胞及精子数量减少。组织病理学结果提示，超高剂量GTW具有明显睾丸毒性，而在一定剂量范围内，正常大鼠表现出一定程度的睾丸毒性，而AA发病状态大鼠睾丸毒性相对轻微。已有研究发现，睾丸组织中NO的含量与雄激素分泌关系密切，并对精子成熟、获能、运动等生殖功能发挥调控作用[8、9]。NO是由NOS在NADPH-II作用下催化 L-精氨酸而产生的，组织中NOS的水平及活性可间接反应NO的含量。基于此，本实验检测了2组大鼠睾丸组织中总NOS的水平。多因素方差分析结果显示，与正常组比较，关节炎发病组大鼠睾丸组织中NOS的水平相对较高，且差异显著。NOS抗体免疫组化显色结果验证了上述结论，即GTW可能抑制了正常大鼠睾丸组织中NOS的表达，从而影响精子细胞及精子的生成。该结果提示，动物在健康态及AA发病态GTW的睾丸毒性存在显著差异。综上，一方面GTW的睾丸毒性与剂量相关:临床等效剂量不存在睾丸毒性，较大剂量可诱发睾丸毒性;另一方面，GTW的睾丸毒性与机体生理状态相关:与正常组比较，相同剂量GTW在AA发病大鼠体内产生的睾丸毒性相对较弱。

目前，对雷公藤毒性及毒理学的研究报道已有很多，但大多袭用了现代毒理学的研究思路和方法，所获得的数据多来自于正常动物，所研究的是药物对正常机体的毒性作用，缺乏中医药的自身特色[10]。众所周知，中药须在中医药理论指导下的使用，临床应用过程中具有辨证用药、配伍解毒、中病即止的特点[11]。《素问·六元正纪大论》有:“妇人重身，毒之何如……有故无殒，亦无殒也”的记载。文中虽然表面上讨论的是妊娠期用药问题，但实质阐述的是中医对中药药性与毒性关系的认识，强调了“药-证”密不可分的道理。古代医家把中药的“毒性”及机体的“不健康状态”理解为“偏性”。中药的治疗原理在于“以偏纠偏”，当药物纠“偏”时表现为治疗效应，而当机体无“偏”时则表现为毒性。上世纪90年代，日本发生了小柴胡汤滥用引发间质性肺炎的事件就是“有故无殒”理论的典型例证[3]。

诚然，中药毒理机制十分复杂，与机体代谢过程、生理状态、作用靶点等密切关联。但要真正揭示中药毒理机制需借助功能基因组学、蛋白组学及代谢组学等技术手段，并结合系统生物学、网络生物学等先进的数据分析方法。本课题组目前正在开展证候动物模型，以及附子、雷公藤等有毒中药对不同证候、不同生理状态动物生物标志物(biomarker)、代谢轮廓(metabolic profile)影响的研究，期望获得更有说服力的实验数据，为适合中医药特点的“中药毒理学”研究提供现代医学及生物学的证据及思路。

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