双组分调节系统对乳酸菌产细菌素过程的影响

杨郁荭，王辉

（1.黑龙江省完达山乳业股份有限公司，哈尔滨 150078；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室/食品学院，哈尔滨 150030）

双组分调节系统对乳酸菌产细菌素过程的影响

杨郁荭1，王辉2

（1.黑龙江省完达山乳业股份有限公司，哈尔滨 150078；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室/食品学院，哈尔滨 150030）

综述了双组分调节系统的组成，以及双组分调节系统对两类细菌素合成的调节作用，来初步了解双组分调节系统在乳酸菌产细菌素过程中的作用机制。

双组分；细菌素；蛋白激酶；反应调节器

0 引言

双组分系统最初是由Ninfa和Magasnik在研究大肠杆菌氮调节蛋白系(Nitrogen Regulatory Protein，NR)时发现的[1]，该系统调节着大肠杆菌的基因表达。

近年来，越来越多有关应用一种称为基于外信息素肽信号转换途径来调节多种细胞活动的革兰氏阳性菌得到报道[2]。这些调节细胞活动包括：细菌感受性的生长（Håvarstein and Morrison,1999）、稳定期时葡萄球菌素的分泌[3]，还包括已知的产生于多种乳酸菌的细菌素。在乳酸菌所产的细菌素中，其中第二类细菌素的转录是通过由3种成分组成的信号转换途径完成的。这3种成分为：诱导类细菌素肽、HPK和RR。事实上，许多抗微生物小肽由细胞密度响应机制所调节。

1 双组份调节系统的组成

典型的双组份调节系统包括HPK和RR两个组分。组氨酸蛋白激酶（HPK）感受器通常位于细胞质膜上以监测环境变化，反应调节器（RR）位于细胞质中并传递来自感受器的信号和调节基因的表达，可以是对一个调节子中的一个或多个基因的表达进行调节[4]，以响应外界的变化。整个双组分信号通路由信号输入（input）、HPK自身磷酸化、RR磷酸化及输出（output）等环节构成。

HPK通常是由一个信号输入模件(input module)和一个自身激酶模件(catalytic module)组成，其中自身激酶模件可分为两个子域：组氨酸磷酸转移酶子域和ATP结合子域。HPK的外界信号输入模件，与蛋白激酶的催化模件相连接，这一结构特点使得HPK能很灵敏地感受外界环境的变化[6]。序列分析表明，这类蛋白质C末端区域是高度保守的，而且由大约240个氨基酸连接数量不变的残基组成。组氨酸残基蛋白质自磷酸化作用消耗ATP，称为H结合位点。G1、G2结合位点是由大量的甘氨酸组成，其序列类似与其他蛋白质的核苷酸结合基序。F、N结合位点通过序列分析，其功能还不是很清楚，大概与蛋白质的催化活性有关（图2）。组氨酸蛋白激酶中的激酶，如EnvZ和NtrB起磷蛋白磷酸酶的作用，OmpR和NtrC在反应调节器中加速去磷酸化的作用。组氨酸蛋白激酶可分为两类：跨膜蛋白和细胞质蛋白，跨膜蛋白能感应环境中的信号，而细胞质蛋白则感应细胞内的信号。许多革兰氏阳性菌种中发现的组氨酸蛋白激酶都为跨膜蛋白。

RR通常是由调节区域，即感受器，和DNA结合区域，即输出器组成。当激酶的输入模件检测到外部的信号时使自身激活，激酶的这个功能是通过组氨酸残基经由ATP水解供能发生磷酸化产生的[7]。随后磷酸基团传递到应答调节蛋白的保守天冬氨酸位点上，使其发生磷酸化。磷酸化的应答调节蛋白，能与DNA或其它信号蛋白发生相互作用，进而调节下游的信号转导。在细菌中，大多数应答调节蛋白是转录因子，能够调节相关基因表达。

图2中，H为组氨酸结合位点；N为天冬氨酸结合位点；G1和G2是不同甘氨酸的结合位点；F为苯丙氨酸的结合位点。

HPK和同源的RR是通过磷酸化和去磷酸化反应来进行沟通的（图3），双组分调节系统信号转导的潜在分子学机理是简单的，然而，它们在是怎样收集环境信号、确信在感受到强烈刺激时输出反应器能够顺利进行等方面的机理却是复杂的。迄今为止，发现了大量的HPK和RR，它们存在于50种不同的细菌和真核生物中，包括链孢霉属、酿酒酵母等。这就可以推论出这种双组分系统在生物有机体中普遍存在。

2 羊毛硫抗生素合成的调节

羊毛硫抗生素是小的热稳定肽，结构中起作用的物质是硫醚环修饰的氨基酸，这类细菌素中最有名的是nisin。羊毛硫抗生素的生物合成、分泌和免疫所需的基因是在群体中构成的，即形成基因簇。nisin的产生开始于对数生长期，在到达细菌密度最高的稳定期时达到最高水平[8]。

基因簇nisABTCIPRKFEG编码nisin的生物合成[9]，除了结构基因、加工处理基因和免疫基因外，基因簇中的nisR（RR）和niskK（HPK）组成了与nisin生物合成有关的双组分调节系统。高产nisin的Lc.Lactis菌株，其nisA基因缺少4个碱基对，称为ΔnisA基因，它不但降低nisin的产生量，而且终止nisA的转录。在加入nisin后，ΔnisA恢复转录功能[10]，因此，nisin的作用不仅是作为细菌素，而且作为一种分泌信号分子来诱导与自身的生物合成有关的基因进行转录，这种信号转导以NisK和NisR为媒介。在B.subtilis中发现了与产nisin菌株Lc. Lactis拥有同样的群体感应机制，基于基因组序列分析，在枯草芽胞杆菌的双组分调节系统（TCS04）中，基因对SpaK/SpaR与产nisin菌株的基因对NisK/NisR具有高度的相似性[11]。

基因簇nisABTCIPRKFEG编码nisin；NisB和NisC是与细胞内翻译信号有关的修饰反应器蛋白；NisT推断为ABC转位分子族中的运输蛋白；NisP是转移前导肽的胞外蛋白酶；AI为自身诱导；NisK是跨膜信号转导蛋白；NisR为反应调节器；NisF、NisE和NisG是一种从细胞到细胞产生免疫性的输出系统；NisI是促成发射器的脂蛋白[12]。

3 第二类细菌素（ClassⅡAMPs）的合成调节

ClassⅡAMPs(Klaenhammer,1993)是小的热稳定的不含羊毛硫氨酸残基的膜活性多肽，它不含有被修饰的氨基酸残基。作为前体肽的ClassⅡAMPs在合成过程中N-末端的延伸在肽分泌后立即进行。ClassⅡAMPs都具有在分离位点前含有两个甘氨酸残基的特征，而不同种类的ClassⅡAMPs对应的分泌机制、免疫机制以及与细菌素产生有关的调节机制已经得到报道，如LactobacillusplantarumC11、LactococcuslactisMG1363、Lactobacillus acidophilusNCFM等菌株在产生细菌素过程中双组分调节系统的作用。

3.1 Lactobacillus plantarum C11产细菌素的调节

L.plantarumC11产细菌素是一个可诱导的过程，由调节系统中的一个外信息素肽plantaricin A触发[13]。经由同源的HPK和RR蛋白的作用产生诱导会导致在细菌活性生长期中5个pln操纵子进行协调转录，在完全进入稳定期前5个操纵子的转录能力开始下降，然后是完全终止转录，随带的是停止产生细菌素[14]。

3.1.1 与细菌素产生有关的5个操纵子的表达调控

一种称为基于外信息素肽信号转换网络对Lacto-bacillus plantarumC11与产细菌素相关的5个操纵子进行表达调控。在这个调节网络结构中，外信息素肽（PlnA）诱导细菌素的产生，主要是通过组氨酸蛋白激酶（HPK）和两种对抗的反应调节器（RR）起作用。细菌素的基因座包含5种操纵子：plnEFI操纵子和plnJKLR操纵子编码细菌素和免疫蛋白；plnGHSTUV操纵子包含有两个甘氨酸N-残基，它作为ABC的转运系统；操纵子plnABCD作为信号转换途径；最后一个操纵子plnMNOP含有一个基因，它在细菌素合成中的功能还不得而知[15]。

在调控操纵子（plnABCD）中，plnA编码外信息素肽PlnA，plnB编码HPK，而plnCD编码两种RR。所有的pln操纵子在不产生细菌素的条件下都处于被抑制状态，当PlnA诱导时，所有转录的5种操纵子以相互联系的方式被调节：它们在菌体的对数生长期都具有活性，但有的在稳定期前活性下降。这种表达使5种操纵子促成了一种通常所说的调节网络[15]。

与Lactobacillus plantarumC11产生细菌素相关的调节操纵子plnABCD所编码的4种不同蛋白分别是：阳离子前肽（PlnA）、组氨酸蛋白激酶（PlnB）和两种高度同源性的反应调节器（PlnC和PlnD）（图4）。成熟的PlnA产物（plantaricin A）作为一种胞外信息素来诱导细菌素的产生，而plnBCD在细菌素产生中所起的具体作用还没有得到实验性的证实[2]。

为了证明了plnABCD操纵子编码自动调节基因使启动子的活性被激活，用一个包含gusA的指示系统结合plnA启动子的方法来研究plnABCD；诱导基因plnA和激酶基因plnB产生蛋白需要自体活化。而后几个基因编码的蛋白（PlnC和PlnD）作为外信息素肽的感受器，这两种反应调节器展现出完全不同的功能，与操纵子plnC和plnD过表达影响细菌素产生的机理相一致：PlnC激活转录并产生细菌素，而PlnD则抑制这两种作用即PlnD在细菌素的合成过程中起负调节作用。PlnD是第一种对产生细菌素直接起负调节作用的蛋白，它与PlnC是由位于同一操纵子上的基因编码的，但却表现出完全相反的功能特性[2]。

3.1.2L.plantarumC11调节操纵子中plnC和plnD的过表达对细菌素产生的影响

L.plantarumC11的五个负责细菌素产生的pln操纵子的转录是被plnA诱导启动的，一旦被诱导，转录在指数生长期的整个过程中发生，但有一些在进入稳定期时立即停止。这意味着存在一个有效的减量调节转录机制，操纵子plnD或独立或结合plnC发挥作用，但在基因活化上被认为是可有可无的，在自身启动子的活化上更是不需要的。因此怀疑它在细菌素的产生过程中起着与plnC不同的作用，换句话说就是作为一个负调节物。在产细菌素菌株中过分表达plnD来证明其是否抑制plnABCD的转录和伴随的细菌素的产生，所得到的结果与只有plnC对基因活化起作用这一模型相一致[2]。

首先，plnC不管plnD是否一起被表达都表现出十分强烈有效的活性，也意味着这两个调节器之间没有明显的协同作用。其次，当两个反应调节器各自过表达时，只有plnC的过表达加强了报道基因的表达。一些实验还表明plnC的功能与HPK的存在有直接的联系。

这些表明plnC在细菌素的产生过程中起积极的调节作用，相反的，plnD则起负调节作用[2]。

3.2 Lactococcus lactis MG1363产细菌素的调节

在Lactococcus lactisMG1363的染色体中已经鉴定出6种双组分调节系统，这些双组分调节系统都包含有一个组氨酸激酶和编码基因的反应调节器。对6种双组分调节系统的转录分析表明，其中两个系统显示出高效的组成性表达，同时剩余的4种在生长期显示出表达。通过插入诱变确定了两个组成性表达的双组分调节系统对于普通细胞的存活和生长以及产生细菌素都是必需的，而通过对剩余4个调节系统的突变分析表明，它们与极端pH值的敏感性、渗透或氧化条件、乳酸乳球菌的磷酸酶活性调节有关[16]。

3.3 Lactobacillus acidophilus NCFM产细菌素的调节

Lactobacillus acidophilusNCFM存在着双组分寡肽转换系统，推断共有九种，其中有一些对细菌素的产生和耐酸性起决定性的作用，每个双组分系统都是由组氨酸激酶和相应的反应调节器组成。其中有两个是反应传感器对，有一对显现出与细菌素lactacin-B的产生有关，另一对是类似于李斯特菌属的耐酸性双组分调节系统，其它双组分调节系统则对细菌素的产生基本没有影响[17]。

3.4 Carnobacterium piscicola LV17 B产细菌素的调节

群体感应系统调节Carnobacterium piscicolaLV17B，至少产生两种细菌素，分别为carnobacteriocin B2 (CB2)和carnobacteriocin BM1(CBM1)，主要应用在肉的真空包装以延长保存期。61 kb的质粒（pCP40）在CB2和CBM1的合成过程中影响很大，precarnobacteriocin B2(cbnB2)与其免疫蛋白(cbiB2)的遗传因子位于pCP40上，而precarnobacteriocin BM1(cbnBM1)与其免疫蛋白(cbiBM1)的遗传因子则位于染色体上。部分pCP40经分析含有在细菌素产生过程中所必需的4种基因（cbnKRTD），CbnT和CbnD的功能与细菌的独立分泌系统有关，而CbnK和CbnR的机能可能是作为双组分信号转换系统[9]。

4 结束语

乳酸菌基因组研究的广泛开展，为人们在分子水平上系统阐述乳酸菌的生理及代谢机制提供了可能[18]。研究者通过生物信息学手段，对已知乳酸菌的基因组进行预测和分析，发现乳酸菌中广泛存在着双组分系统，这些双组分系统中有一些对乳酸菌产细菌素具有直接的调节作用，有一些则通过调控细菌耐酸、抗氧化及耐渗透压能力来调控细菌素的产生。但对于如何控制外界因素来调节双组分系统进而调节细菌素的产生还没有见报道过，因此设想如果能利用外界因素来控制双组分系统中有利于细菌素产生的成分对于大量工业化生产细菌素具有重大的意义。

[1]CHANG C,STWWART R C.The Two Component System:Regulation of Diverse Signaling Pathways in Prokaryotes and Eukaryotes[J]. Plant Physiol,1998,117(3):723-731

[2]DIEP D,JOHNSBORG O,ARNE P.Evidence for Dual Functionality of The Operon plnABCD in The Regulation of Bacteriocin Production in Lactobacillus plantarum[J].Molecular Microbiology,2001, 41(3):633-644.

[3]NOVICK R P.Regulation of Pathogenicity in Staphylococcus aureus by a Peptide-Based Density-Sensing Mechanism.In Cell–Cell Signaling in Bacteria.Dunny,G.M.,and Winans,S.C.(eds)[J].Washington,DC:American Society for Microbiology Press,1999,pp.129–146.

[4]AZCARATE-PERIL M,MCAULIFFE O,ALTERMANN E,et al.. Microarray Analysis of a Two-Component Regulatory System Involved in Acid Resistance and Proteolytic Activity in Lactobacillus acidophilus[J].Applied and Environmental Microbiology,2005:5794-5804.

[5]邱全胜.双组分系统——细胞识别渗透胁迫信号的感应器[J].生物化学与生物物理进展,2000,27(6):593-595.

[6]类延宝,宋松泉,傅家瑞,等.植物的双组分信号系统[J].植物学通报,2004,21(2):216-227.

[7]PFEILER E,ANDREA M,KLAENHAMMER T.Characterization of a Novel Bile-Inducible Operon Encoding a Two-Component Regulatory System in Lactobacillus acidophilus[J].Journal of Bacteriology, 2007:4624-4634.

[8]KLEEREBEZEM M,Quadri L,Kuipers O,et al.Quorum Sensing by Peptide Pherpmones and Two-Component Signal-Transduction Systems in Gram-positive Bacteria[J].Molecular Microbiology,1997,24 (5):895-904.

[9]KLEEREBEZEM M,KUIPERS O,ET AL.A Two-Component Signal-Transduction Cascade in Carnobacterium piscicola LV17B: Two Signaling Peptides and One Sensor-Transmitter[J].Peptides, 2001,22:1597-1601.

[10]KUIPERS O P,BEERTHUIZEN,M.M.,DE RUYTER,ET AL. Autoregulation of Nisin Biosynthesis in Lactococcus Lactis by a Signal Transduction[J].The Journal of Biological Chemistry,1995,270: 27299-27304.

[11]HOLS P,HANCY F,FONTAINE L,ET AL.New Insights in The Molecular Biology and Physiology of Streptococcus Thermophilus Revealed by Comparative Genomics[J].FEMS Microbiology Reviews,2005,29:435-463.

[12]QUARDRI L E N.Regulation of Antimicrobial Peptide Production by Autoinducer-Mediated Quorum Sensing in Lactic acid Bacteria[J]. Antonie van Leeuwenhoek,2002,82:133-145.

[13]DIEP D B,HAVARSTEIN L S.,and NES I F.A Bacteriocin-Like Peptide Induces Bacteriocin Synthesis in Lactobacillus Plantarum C11 [J].Mol Microbiol,1995,18:631-639.

[14]DIEP D B,VARSTEIN H.Characterization of The Locus Responsible for The Bacteriocin Production in Lactobacillus Pantarum C11[J]. J Bacteriol,1996,178:4472-4483.

[15]DIEP D,MYHRE R,JOHNSBORG O,ET AL.Inducible Bacteriocin Production in Lactobacillus is Regulated by Differential Expression of the pln Operons and by Two Antagonizing Response Regulators,the Activity of Which is Enhanced Upon Phosphorylation[J]. Molecular Microbiology,2003,47(2):483-494.

[16]CONNELL-MOTHERWAY M,SINDEREN D,MOREL-DEVILLE F,ET AL.Six Putative Two-Component Regulatory Systems Isolated from Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1363[J].Microbiology,2000,146:935-947.

[17]ALTERMANN E,MICHAEL W,ANDREA M,et al.Complete Genome Sequence of the Probiotic Lactic Acid Bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM[J].PNAS,2004,102(11):3906-3912.

[18]MAKAROVA K S,KOONIN E V.KOONIN Evolutionary Genomics of Lactic Acid Bacteria[J].J Bacteriol,2007,189(4):1199-1208.

Effect of two-component regulatory system involved in bacteriocin production in lactic acid bacteria

YANG Yu-hong1,WANG Hui2
(1.Heilongjiang Wondersun Dairy Co.Ltd.,Harbin 150078,China;2.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of E-ducation,and Food Science&Technology College,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

This review aims at describing the composition of two-component regulatory systems and the regulation of two-component regulatory systems in two class bacteriocin synthesis,understanding the mechanism of two-component regulatory systems involved in bacteriocin production inlactic acid bacteria.

two-component;bacteriocin;histidine protein kinase;response regulators

Q936

B

1001-2230（2011）06-0051-04

2011-03-01

杨郁荭（1968-），女，工程师，从事发酵乳制品的研究与开发。