酶联免疫法与乳及乳制品中抗生素残留的检测

邵辉，吴瑕，王剑飞，王鑫，

（1.黑龙江农业工程职业学院，哈尔滨 150001；2.东北农业大学黑龙江省乳品工业技术开发中心哈尔滨 150086；3.东北农业大学成栋学院，哈尔滨 150030）

酶联免疫法与乳及乳制品中抗生素残留的检测

邵辉1，吴瑕2，王剑飞3，王鑫2，

（1.黑龙江农业工程职业学院，哈尔滨 150001；2.东北农业大学黑龙江省乳品工业技术开发中心哈尔滨 150086；3.东北农业大学成栋学院，哈尔滨 150030）

对酶联免疫检测技术（ELISA）做了介绍，并对该技术在乳及乳制品抗生素残留检测的应用进行了评述。阐述了该项技术在乳及乳制品抗生素残留检测中的应用前景。

酶联免疫；乳及乳制品；抗生素残留；快速检测

0 引言

牛奶是人们的主要营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮者来说无疑等于长期服用小计量的抗生素，对抗生素有过敏体制的人群引用，可引起过敏反应[1]，轻至各种皮疹，重至过敏性休克甚至危害生命[2]。从乳制品加工角度来看，原料乳中抗生素残留会严重干扰发酵乳制品的生产，严重影响干酪、黄油、发酵乳的发酵和后期风味的形成[3]。因此，大多数国家开始对乳及乳制品抗生素残留问题提出更高的要求，检测技术日益趋于高技术、速测化、便携化和易商品化发展。运用免疫学和生物工程技术所建立的酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)技术，在食品安全性检测上表现出了独特的优势，在测定乳及乳制品抗生素残留上有着广泛的应用前景。

1 酶联免疫检测技术

酶联免疫技术是20世纪60年代在免疫荧光和组织化学基础上发展起来的新技术。1966年，以Engvall、 Perlmann和Schurs为先驱，发展了酶联免疫测定方法，到1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附测定(ELISA)用于IgG定量测定的文章，使得1996年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法［4］。首次将抗体上的酶标记用于兔免疫球蛋白上代替在免疫分析方法中应用的常规放射标记。ELISA灵敏度与放射免疫分析法相同。但是和放射免疫分析法不同的是其克服了放射免疫分析方法的缺点如暴露的放射性对人体健康的潜在危害及不需要用到昂贵的闪烁计数器［5，6］。

ELISA的基础是抗原和抗体的固相化及抗原和抗体的酶标记。基本原理是：使抗原抗体结合到某固相载体的表面，并保持其免疫活性；抗原或抗体与酶结合形成酶标记抗原抗体复合物，既保持其免疫活性又保留酶的催化活性；在测定时，把受检标本（测定其中的抗原或抗体）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应；用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标准受检物质的量直接相关，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度［4］。在应用中一般采用商品化的试剂盒进行测定，其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，简化了操作步骤。完整的ELISA试剂盒包含以下组分：包被抗原或抗体的固相载体（固相吸附剂）；酶标记的抗原或抗体；酶的底物阴性和阳性对照品（定性测定），参考标准品和控制血清（定量测定）；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应终止液。结合物即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持酶的催化活性，也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。在ELISA中常用的酶是腊根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和碱性磷酸酶（alkaline phoaohatase,AP）［7，8］。在少数商品ELISA试剂中，应用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶（AP）作为标记酶［8］。酶标记抗体的制备主要有戊二醛胶联法和过碘酸盐氧化两种方法。酶结合物一般需经离子交换层析或分子筛分离纯化。最常用的方法是通过Sepharose 4B或Sephadex G-200等进行胶过滤。

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。其中抗生素残留中常用的是以下3种类型［4］：双抗体夹心法；间接法；竞争法。

2 在抗生素残留检测中的应用

与传统的微生物检测法和理化方法相比，ELISA方法具有高度的准确性、特异性、食用范围宽、检测速度快等优点，目前已成为乳及乳制品中抗生素残留检测中广泛应用的方法。大部分抗生素已经建立了ELISA测定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、四环素、青霉素、链霉素等。吴定等［9］以BSA为载体合成两种不同摩尔比值（1︰13和1︰42）磺胺甲基嘧啶人工抗原，并比较其免疫原性。免疫家兔后获得抗SMD多克隆抗体，并已建立了乳中磺胺甲基嘧啶残留的ELISA方法，标准曲线的工作浓度为88%～118%。抗血清与磺胺甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉反应率分别为6.0%和0.84%，而与其他磺胺类药物无交叉反应。吴定等以BSA为载体合成摩尔比为1︰14的新诺明蛋白质免疫原，建立了乳中新诺明残留竞争酶联免疫吸附分析方法［10］。吴定等用2.5%戊二醛作胶联剂，分别合成牛血清白蛋白-氨苄西林钠抗原和卵白蛋白-氨苄西林钠抗原，建立了快速测定乳中氨苄西林钠含量的酶联免疫吸附法［11］。杨红用兔抗磺胺二甲嘧啶血清，建立了磺胺二甲嘧啶的ELISA法［12］，方法简便快速，重现性好，检出限度低。周斌等［13］以人工合成的氯霉素-牛血清白蛋白（CAPBSA）为包被抗原，氯霉素(Chloramphenicol,CAP)为竞争的半抗原，建立了快速定量测定CAP质量分数的间接竞争酶联免疫试验。

由于对乳及乳制品中抗生素残留量需快速检测，众多开发商研制开发了ELISA试剂盒的形式。其基本原理［14］是将特定抗生素类群（如β-内酰胺类）作为靶子，让固定在一定部位的特定的特定抗体或光谱受体（如微生物细胞）捕捉。大多数检测法利用竞争性原理，使样品内的抗生素与内置抗生素标志物竞争固定抗体或光谱受体结合，然后进行冲洗和显色。内置抗生素标志物与固定抗体或广谱受体形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质或发光物质。乳制品中的残留抗生素与固定抗体或光谱受体形成的复合体，通过酶的作用分解无法形成有色物质或发光物质。通过测定色度或光度并与参比物对照，就可判断结果呈阴性还是阳性。因为应用竞争性原理，最终的反应结果颜色越深或光度越强表示阴性，反之表示阳性。

美国Idexx实验室生产的针对β-内酰胺类抗生素的LacTek内酰胺检测法是一种适合在实验室进行的检测法，7 min就可以得出结果。检测时将乳样和竞争性酶示踪物加入涂有固定抗体的试管中，在室温下振荡，使牛奶中抗生素与酶示踪物竞争与固体抗体结合，然后将试管用冲洗液冲洗，随后加入显色剂，显色结果用分光光度计检测。如果乳样中有抗生素残留，则会抢占酶示踪物的结合位点，使酶示踪物在冲洗时被洗掉，加入显色剂后，形成色度较浅或并无显色现象。该实验室开发的SNAP检测法，由一个试管和一个装有试剂的一次性塑料装置组成，它利用毛细管现象拖拽乳样和酶示踪物试剂通过固定抗体。10 min可得到试验结果。

3 应用前景

目前以用于检测乳及乳制品抗生素残留检测的方法主要有3种：微生物受阻法、理化检测法、免疫学分析法。微生物受阻法虽然有了新的发展，但还存在检测需时长，操作复杂，很难筛选达到对同类抗生素的不同药敏性的特异菌株等缺点。理化检测法设备昂贵，检测费用高，需要复杂的样品前处理，很难推广使用。免疫分析方法中的酶联免疫吸附分析（ELISA）是目前绝大多数试剂盒采用的方法，准确度高，特异性强，快速便捷，但检测费用很高，受到对主要设备的要求以及供货连续性等因素的影响。这些方法虽然各有缺点和局限性，相比之下，在实际中只有应用ELISA检测技术才能最大程度上满足乳及乳制品抗生素残留快速检测所需求的条件。随着一些基础研究的进展以及用于食品分析的ELISA试剂盒的大量生产，使ELISA方法的优势更加明显，更加符合食品分析要求的准确、快速、简便易操作，因此可以预言在未来的乳及乳制品抗生素残留检测中，ELISA将会成为很重要的一个技术手段，并将引起世界各国的广泛重视和深入研究。

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Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and detection of antibiotics residues in milk and milk products

SHAO Hui1,WU Xia2,WANG Jian-fei3,WANG Xin2
（1.Heilongjiang Agriculture Project Profession clooege，Harbin 150001，China;2.Heilongjiang Dairy Industrial and Technical Reseearch Center,Northeast Agricultural University,Harbin 150086,China；3.Chengdong College of Northeast Agriculture University,Harbin 150030,China)

In this paper,the technology of Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)was introduced first.Meanwhile,the application of ELISA in the detection of antibiotics residues in milk and milk products was commented.Finally the prospect of ELISA in the detection of antibiotics residues in milk and milk products was also forward promoted.

ELISA;milk and milk products;antibiotics residues;rapid detection

TS252.7

B

1001-2230（2011）06-0058-02

2010-12-22

邵辉（1977-），女，工程师，研究方向为畜产品加工。