乳及乳制品三聚氰胺残留HPTLC检测方法的初步建立

孟兰环，刘兴凯，郭军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018）

乳及乳制品三聚氰胺残留HPTLC检测方法的初步建立

孟兰环，刘兴凯，郭军

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018）

以开发低成本和高通量的三聚氰胺（MA）检测方法为目的，初步建立用高效薄层色谱（HPTLC）检测乳及乳制品中三聚氰胺的方法。用高效硅胶G板，以四氢呋喃、水和冰醋酸为展开剂，氯气和碘-淀粉试剂为显色剂检测牛乳中的MA，检出限可达5～2.5 mg/L；而用一种初步尝试的浓缩展开原理，MA检出限可达1.0～0.5 mg/L水平。利用HPTLC完全可以建立一类廉价、操作简便和高检测效率的MA残留检测方法。

三聚氰胺；薄层层析；牛乳

0 引言

2010年11月国家质检总局颁布了“乳制品和婴幼儿配方乳粉生产许可条件审查细则”，其中有条款要求企业必需自行严格检测三聚氰胺（Melamine,MA）。然而国家推荐的三种MA检测方法[1-3]设备昂贵，维持和耗材费用高，实验室条件要求高，操作复杂耗时。企业为满足高通量、快速检测需要，还采用昂贵的进口免疫标记试剂盒。2009年以来我们尝试用高效薄层色谱（High Performance Thin Layer Charamotograph，HPTLC）法检测牛乳中污染的MA，检出限可达5.0 mg/L水平（图1）。可喜的是经过展开原理的创新性改进（样品在展开过程中被浓缩），检出限可达1.0 mg/L，甚至达0.5 mg/L水平（图2），但可重复性和稳定性有待进一步研究提高。现将成熟的部分简报如下。

1 实验

1.1 材料

普通硅胶G60层析板（自制）[4]，预制高效硅胶G板（批次：2010年8月，规格100 mm×100 mm和100 mm× 150 mm），四氢呋喃、冰醋酸、高锰酸钾、盐酸、可溶性淀粉、碘化钾均为分析纯。三聚氰胺（MA）标准品，纯度99%，进口分装。

SB-3型薄层色谱喷雾泵。

1.2 方法

1.2.1 标准MA牛乳制备

准确称取0.01 g三聚氰胺，用无MA牛乳溶解定容至100 mL，相当于含100 mg/L的三聚氰胺牛乳溶液，再用无MA牛乳制备100 mg/L至0.5 mg/L的MA标准浓度梯度系列，点样时用蒸馏水做1:1稀释。见表1。

1.2.2 氯气的制备

按无机化学氯气制备原理和反应式制备。称取3 g高锰酸钾和5 mL浓盐酸在氯气制备器中混合，制得1 L氯气，通入密闭容器保存。

1.2.30.5%淀粉碘化钾溶液的制备

称取可溶性淀粉0.5 g加入至100 mL温度为80～90℃的蒸馏水中，煮沸至完全透明，冷却至室温，加入0.5 g KI溶解，过滤，避光冷藏保存[5]。

1.2.4 点样

将MA标准牛乳溶液和指控样品牛乳用蒸馏水做1︰1稀释（体积比）。然后在距薄层板底边1.0 cm处手工点状点样2.0 μL，点间距为10 mm。100×100 mm薄层板可点9个乳样，100×150 mm可点14个乳样，100× 200 mm可点19个乳样。

1.2.5 展开

基本展开剂为四氢呋喃︰水（9.5︰0.5，体积比）、四氢呋喃︰水︰冰醋酸（9.5︰0.25︰0.25,体积比），另外初试了一种创新性原理的“浓缩展开剂”。均上行展开，无需饱和，展开剂距原点0.5 cm，展距7 cm，展开时间均约10 min。

1.2.6 显色

将展开后的薄层板在空气中晾干，置于充满氯气的密闭容器中5 min，取出，通风放置5 min挥发氯气，质量分数0.5%淀粉碘化钾溶液喷雾显色后目视观察结果。在背景光下观察结果更明显。

2 结果

结果如表1，图1和图2所示。普通层析板上检出限在50～40 mg/L左右；本次使用的国产高效层析板用常规展开原理检出限可达30～20 mg/L，使用本研究创新的浓缩展开原理后，检出限可达5.0～2.5 mg/L。而初步优化的浓缩展开剂，可使薄层层析检出限达1.0 mg/L，甚

图2中，1，2，4，6，8，10，12道MA质量浓度分别为10，8.0，6.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mg/L；3，5，7，9，11道为被检乳样，MA质量浓度约2.5 mg/L。至0.5 mg/L。用四氢呋喃和蒸馏水为展开剂，容易出现Rf值与MA接近的干扰物质，而用冰醋酸酸化的展开剂和浓缩展开剂则对MA的分离效果增强。在本实验使用的高效层析板，MA的Rf值为0.5，不同浓度样品的Rf值一致，没有干扰物质。采用浓缩展开原理，展开中MA被浓缩，因此斑点呈椭圆型（图1）、弦月形或线形（图2），检出限大大提高。

一个薄层板操作时间30～60 min，一个100×100 mm的小型薄层板可检测5～9个乳样，而100×150 mm或100×200 mm的薄层板可检测14～19个样品，则一个乳样平均检测时间仅为数分钟。显然HPTLC检测效率很高，适合大批量乳样的MA检测。

3 讨论

表1 标准MA牛乳浓度和HPTLC检测结果

图1中，从左至右MA质量浓度为0，50，40，30，20，10，5，2.5 mg/L。使用了样品斑点浓缩技术。

目前国际上推荐使用和报道的MA检测方法较多，但除了本研究外仅检索一篇Melanie Broszat等用TLC建立MA定量检测方法的报道，但展开剂与本研究完全不同，检出限也仅为30 mg/kg水平[6]。TLC在色谱家族使用范围最宽，因此被誉为“万能色谱法”，但相对其他后来发展的色谱方法，TLC灵敏度低、在接近检测极限时重复性、稳定性较差。这可能也是众多开发者没有选择TLC来建立MA检测方法的原因。本研究组在2009年初独立研究建立了TLC检测MA方法，但因检出限与2008年国家临时制定的MA监控限量（2.5～1.0 mg/kg）[7]差距太大而未作报道，并一度中断研究实验。随着对“现代薄层层析法”和“高效薄层层析（HPTLC）”潜能认识的加深，我们重新调整思路，在大量实验中找到了一种提高TLC法检测MA灵敏度的关键原理——浓缩展开原理，并获得了初步实效。但众所周知，薄层板材料、型号和展开剂理化性质的变化以及这两者的交互作用变化十分敏感，因此本研究建立的方法在稳定性、重复性方面仍需做较多的实验，并完善MA的HPTLC定量分析方案。后续研究将另行报道。

本研究证明，HPTLC检测MA是完全可行的，而且灵敏度还有望优化提高。与目前国家推荐的3种方法[1-3]相比，用该方法进行定性或半定量检测无需特殊仪器、样品前处理简单，检测效率高，无疑会成为一种高通量、检测成本低廉的MA检测方法,尤其适合在企业进行大批量原奶、奶粉及其他原料、辅料和添加剂的高通量检验和筛选检验，适合监控意外严重污染的突发。

[1]中华人民共和国国家标准.GB/T 22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法[S].北京：中国标准出版社，2008.

[2]中华人民共和国国家标准.GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2008.

[3]中华人民共和国农业行业标准.NY/T 1372-2007饲料中三聚氰胺的测定[S].北京：中国标准出版社，2007.

[4]何丽一.平面色谱方法及应用[M].北京：化学工业出版社.2005：29.

[5]侯曼玲.食品分析[M].北京：化学工业出版社，2004：211.

[6]MELANIE B,REGINA B,BERND S.A New Method for Quantification of Melamine in Milk by Absorption Diode-Array Thin-Layer Chromatography[J].Journal of Planar Chromatography，2008,21(6): 469-470.

[7]中华人民共和国卫生部2008年10月08日.卫生部发布会介绍三聚氰胺临时管理限量值规定等[N/OL].中央政府门户网站.http://www. gov.cn/xwfb/2008-10/08/content_1115170.htm.

Preliminary establishment of a high sensitivity melamine determination method by HPTLC

MENG Lan-huan,LIU Xing-kai,GUO Jun
（Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China）

To develop low-cost and high throughput method for melamine(MA)determination in milk and dairy product,a sensitive high performance thin layer chromatographic(HPTLC)method was initially established.MA concentrated during developing on plate.On a high performance silica gel G plate(domestic product),with tetrahydrofuran,water and acetic acid as the basic developing agent,Chlorine and iodine/starch reagent applied as staining reagent,the detection limit reached 5.0～2.5 mg/L,even reached 1.0～0.5 mg/L level in optimized experiment.Obviously HPTLC can be use to build an inexpensive,easy operating and high efficient MA residues detection.

Melamine,HPTLC,milk

TS252.7

A

1001-2230（2011）06-0060-02

2011-03-01

孟兰环（1984-），女，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。通讯作者：郭军