婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定方法

郝岩平，张秋梅，王象欣

（东北农业大学，黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150086）

婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸的测定方法

郝岩平，张秋梅，王象欣

（东北农业大学，黑龙江省乳品工业技术开发中心，哈尔滨 150086）

采用碱性磷酸酶先将样品中的核苷酸酶解为核苷，然后用高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸总量。试样经水提取，通过调pH值沉淀蛋白质，样液中的核苷酸经碱性磷酸酶水解生成核苷，再通过快速加热的方式终止酶解反应，同时进一步去除杂质，用磷酸二氢钾及甲醇作流动相，用普通C18色谱柱，采用梯度洗脱的模式对5种核苷进行有效分离。本方法回收率在92.4%～103.7%之间，相对标准差2.0%～8.0%。核苷酸各组分定量限：CMP为0.6 mg/100g，UMP为0.7 mg/100g，IMP+AMP为0.5 mg/100 g，GMP为0.4 mg/100 g（均为质量分数）。该方法简便、快速、准确,完全能满足婴幼儿配方食品中核苷酸总量测定的要求。为核苷酸检测开辟了全新的途径。

配方食品；乳粉；核苷酸；核苷；高效液相色谱

0 引言

人乳中天然的核苷酸质量浓度很高，而牛乳中天然核苷酸质量浓度低，为了使牛乳更接近母乳许多企业在乳粉中添加核苷酸，现在在婴儿配方食品和奶粉中添加的核苷酸品种主要有以下5种：胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸和次黄嘌呤核苷酸。

目前一些企业采用湿法工艺生产婴幼儿配方食品，在标准化工艺阶段添加核苷酸后，由于乳中本身含有一定量的磷酸酶会使核苷酸脱磷酸而变成核苷导致核苷酸结果偏低，又因核苷的生理作用与核苷酸近似，若只检测核苷酸，不能真实反映出产品中核苷酸的含量。本研究用碱性磷酸酶先将样品中的核苷酸酶解为核苷，以核苷为测定目标物，建立了高效液相色谱法测定婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸总量的简便、准确的检验方法。

1 仪器与材料

主要仪器：天平，pH计，培养箱，电炉，水浴锅，微波炉，高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器。

试剂：淀粉酶，盐酸，氢氧化钠，乙酸，醋酸钠，碱性磷酸酶，叠氮化钠，甲醇，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，核苷酸标准品，核苷标准品。

2 样品的处理方法的确定

2.1 蛋白质分离的方式

样品的处理主要考虑的是既能将样品中的蛋白质分离出去，又能将核苷酸无损失的提取出来。为此将样品用水溶解，用质量分数为10%乙酸及调pH值的方法沉淀蛋白质：10%乙酸沉淀蛋白沉淀蛋白质的方法是将充分溶解的样品转入50 mL容量瓶中，加入5 mL质量分数为10%乙酸，定容，充分混匀后用滤纸过滤；调pH法沉淀蛋白质的方法是用稀盐酸溶液将充分溶解的样品溶液的pH值调至4.5，转入50 mL容量瓶中用水定容，混匀，用滤纸过滤。上述滤液通过0.45 μm的滤膜过滤后上机测定。通过对测定色谱图进行分析后发现：上述处理方式沉淀蛋白，杂质峰都多，且与目标峰分离不开。进一步去除杂质后，通过调pH来沉淀蛋白质的方法杂质少，分离情况好，根据上述蛋白质分离方法的比较，确定采用调pH值来沉淀蛋白质的方法。

2.2 最佳酶解的条件的选择

酶解pH值的选择：经过大量的实验确定酶解的最佳pH值为8.2。

酶用量及酶解时间长度的选择：碱性磷酸酶价格较高，它的用量直接影响到酶解的效果及本方法的操作成本和检测速度，实验表明碱性磷酸酶的用量越大需要的酶解时间越短，碱性磷酸酶用量越少需要的酶解时间越长，经过大量实验摸索比对，结果表明每1 g样品用30活力单位的酶，酶解3 h即可达到最佳效果。

2.3 去除其他杂质的方式

在去除蛋白后还有许多杂质影响分析，曾经考虑采用预柱分离的方法去除这些杂质，试过几种预柱，效果都不理想，经过与预柱专家细致的讨论切磋后决定放弃使用预柱分离，并大量查阅资料，同时与乳品工艺专家请教讨论，尝试着在沉淀蛋白过滤后酶解前进一步调样品的pH值到碱性，酶解后加热，去除杂质。实验过程如下：调pH值所用试剂的选择：使用磷酸氢二钾、氢氧化钠、醋酸钠调样品的pH值至碱性，酶解后加热，去除杂质。结果表明用氢氧化钠调pH值的效果比用其他缓冲盐调pH值的效果要好，杂质明显的少，故选定用氢氧化钠调pH值。

pH值的控制：pH值从7.5～9.0作了大量实验，结果表明pH值为8.2为最佳，即可满足酶解的要求又可有效的去除杂质。

加热方式的选择：比较了用微波炉加热、热水浴加热及电炉加热等加热方式，感觉差别不大，但加热速度应尽量快，鉴于微波对人体有害、热水浴加热速度慢且不方便，故采用事先预热好的电炉加热的方式。

3 色谱条件

3.1 色谱柱的选择

色谱柱性能是待测物能否达到理想的分离度、方法成功的关键之一。

在色谱柱的选择上，先后采用了phenomenex Luna 5 μm C18 250mm×4.60mm，phenomenexLuna 5 μm C18 150mmⅹ4.60mm，diamonsil C18 5 μm 250mm× 4.60mm结果发现：phenomenexLuna 5 μm C18 150mm×4.60mm柱分离效果好，检测时间短。因此，选用phenomenex Luna 5 μm C18 150mm×4.60mm柱。

3.2 流动相的选择

3.2.1 流动相的组成成分的选择

资料上测定核苷酸的流动相种类很多，有用水的、磷酸盐、草酸盐、醋酸盐的等等，经过比较磷酸盐效果更好一些，选用浓度为0.01 mol/L的磷酸二氢钾作为流动相主成分，盐的浓度极低对于色谱柱的寿命大有益处。

3.2.2 流动相的pH值

流动相的pH值影响到目标物质的出峰时间及与杂质的分离效果，考虑到各个核苷的性质，对pH值在3.0～7.0之间的流动相进行实验，试验证明：pH为6.0时，经过酶解后的核苷酸的5个色谱峰以及杂质峰能够完全分开，灵敏度比较高，最终确定选择pH值为6.0。

3.2.3 甲醇的体积分数

由于色谱柱分离耗时极长，我们考虑在流动相中加入部分甲醇，以缩短分离时间，经过大量实验最终决定在流动相B液中加入质量分数为10%的甲醇。

3.3 梯度洗脱条件的选择

由于色谱分离耗时极长，一度达到一个样品在色谱仪上运行需要的时间为1.5 h，无论怎么调整都没有明显效果，最终决定采用梯度洗脱的方法，经过大量摸索确定了洗脱条件，在下面条件下每个样品色谱分离所需时间缩短为22 min。

表1 梯度洗脱程序

4 核苷酸转化成核苷的转化率

用核苷标准品对核苷酸标准溶液进行测定，每份标准溶液加1 mg碱性磷酸酶、酶解3 h，对每种核苷酸转化为核苷的效率进行了实验研究。结果表明：CMP、UMP与GMP 3种核苷酸转化为核苷的转化率达100%；由于在酶解过程中，其中的AMP全部转化为肌苷，所以最终测定的实际上是AMP与IMP之和。经试验证明与分别对AMP与IMP酶解后的测定结果之和与混合酶解后的测定结果无差异，说明AMP全部转化为肌苷后对测定核苷酸总量结果不受影响。实验结果如表2所示。

5 标准和试样核苷酸色谱图

图1～图3为核苷酸标样、样品、样品+核苷酸（复合）色谱图。图中出峰顺序为CMP（3.75min），UMP（5.35min），IMP（+AMP）（10.6min），GMP（11.5min）。

表2 核苷酸转化率统计结果

表3 核苷酸标准系列质量浓度及峰高间回归方程与相关系数

6 标准曲线的绘制

将核苷酸标准溶液用pH值为8.2±0.1的水稀释成不同浓度的标准系列，加碱性磷酸酶，放入培养箱中在37℃下培养3 h。取出，放在事先预热好的电炉上，强火加热至刚刚沸腾，取下冷却至室温，水定容配成核苷酸系列标准工作液。

分别用不同浓度的标准工作液进样，以浓度为横坐标，峰高为纵坐标，绘制标准工作曲线，通过回归计算求得回归方程和相关系数，可见在一定质量浓度范围内质量浓度与峰高间呈正相关，相关性好，可用于外标法进行定量测定，结果如表3所示。

7 准确度实验

选择奶粉、豆粉、米粉作为测试样品，并向样品中加入一定量的标准溶液，采用前面确定的方法处理测定，结果如表4所示。

由表4可以看出，回收率均在92.4%～103.7%之间，该方法准确度满足实验要求。

表4 方法回收率实验

8 精密度实验

取奶粉、豆粉、米粉样品各3个梯度，每个梯度重复测定6次，结果如表5所示。

由表5可以看出，各类样品各个梯度的日内重复测定标准偏差均小于10%，符合实验要求。

9 检出限及定量限

9.1 方法最低检出限

根据GB/T5009.1-2003，中A 2.1色谱法的计算方法。计算检出限：

表5 奶粉、豆粉、米粉各低、中、高3种浓度下的日内重复性实验mg·(100g)-1

式中：b为标准曲线回归方程中的斜率，响应值/微克或响应值/納克；S为仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。结果确认检出限：CMP为0.07 mg/L；UMP为0.08 mg/L；IMP+AMP为0.05 mg/L；GMP为0.04 mg/L。

9.2 样品定量限

根据定量限定义，以信噪比为10倍时的溶液浓度为定量限，考虑称样量及样品处理过程中的稀释倍数，计算出本方法样品的定量限如下：

10 最终实验方法的确定

样品处理：5 g样品温水溶解，调pH值为4.5，用水定容50 mL，过滤，加碱性磷酸酶，调pH值为8.2，在37℃下酶解3 h，取出快速加热沸腾，冷却定容，过滤，上机。

色谱条件：流动相A液浓度为0.01 mol/L磷酸二氢钾（pH值为6.0），质量分数为0.02%迭氮化钠；了流动相B液浓度为0.01 mol/L磷酸二氢钾（pH值为6.0），质量分数0.02%迭氮化钠，质量分数为10%甲醇。色谱柱为C18色谱柱（150×4.6 mm，5 μm）；流速为1 mL/min；波长为254 nm；柱温为（30±2）℃；进样体积为50 μL。色谱程序如表6所示。

表6 梯度洗脱程序

11 结论

经实验验证：本方法的简便、快速、可操作性强、成本低，其准确性、重现性、检出限等完全能满足婴幼儿配方食品中核苷酸含量测定的要求。

本方法适用于婴幼儿配方食品和乳粉中核苷酸总量的测定。包括：胞嘧啶核苷酸（CMP），尿嘧啶核苷酸（UMP），腺嘌呤核苷酸（AMP），鸟嘌呤核苷酸（GMP），次黄嘌呤核苷酸（IMP）。

12 讨论

12.1 核苷酸酶解为核苷情况

从牛肠黏膜提炼而来的碱性磷酸酶（p7640），可以将5种核苷酸脱磷酸转化为相应的核苷：胞嘧啶核苷酸（CMP）转化为胞苷，尿嘧啶核苷酸（UMP）转化为尿苷，腺嘌呤核苷酸（AMP）转化为腺苷，鸟嘌呤核苷酸（GMP）转化为鸟苷，次黄嘌呤核苷酸（IMP）转化为肌苷，其中的腺苷进一步脱氨转化为肌苷。腺苷进一步转化为肌苷的程度因酶解条件的不同而变化，经试验无论转化程度如何，其腺苷和肌苷含量的总和基本不变。鉴于本标准测定的是五种核苷酸的总量，为提高测定结果的准确度，采用了可使腺苷全部转化为肌苷的酶解条件，计算时只计算IMP的质量分数。其他三种核苷酸仍分别计算，核苷酸总量即为实际测定的是涵盖有AMP的五种核苷酸测定结果的总和。

12.2 本方法核苷酸测定结果的讨论

由于碱性磷酸酶在将核苷酸转化为核苷后，测定的实际上是测定核苷的量。由于样品中往往存在质量分数不等的游离态核苷成分，该法测定结果也包括在内，所以测定结果往往比实际添加的核苷酸偏高。对于以乳基为主的样品中的本地值较低，其核苷酸的测定结果差异较小；但对于含豆基的样品则本底值相对较高。采用该法分别对全脂奶粉与速溶豆粉样品进行了本底值的测定：全脂奶粉一般在（2～10）mg/100g，速溶豆粉一般在（20～100）mg/100g。由此可看出：采用该法测定的核苷酸质量分数并非全部为添加的核苷酸，还包括了样品本身含有的核苷等。所以在使用不同的原料时应注意本地值的质量分数，以便使产品中核苷酸的总量不要超过标准规定。

本方法样品处理过程中不加碱性磷酸酶可直接测定样品中的游离核苷质量分数。

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[3]张燕婉,鲁红军,王津生.高效液相色谱法测定食品中核苷酸的含量[J].食品科学,1994(6):59-62.

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Research on determination of nucleotides in infant formula food and milk powder

HAO Yan-pin，ZHANG Qiu-mei，WANG Xiang-xin
（Northeast Agricultural University,Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Harbin 150086,China）

We first employ alkaline phosphatase to hydrolyze nucleotides to the corresponding nucleosides and establish a method for which detects the total nucleotides in infant formula food and milk powder using HPLC.The sample is extracted by water,and eliminated of protein by adjusting pH.Then the nucleotides in sample are degraded into nucleosides.This enzyme has been heat deactivated in order to stop reaction and remove impurities further.The chromatographic separation was achieved using a C18 column and a gradient elution with a mixture of two solvents,which effectively separate five kinds of nucleosides.The range of recovery rates of is 92.4%～103.7%and the range of relative standard deviations is 2.0%～8.0%.The detection limits for these nucleotides are:CMP 0.6 mg/100 g、UMP 0.7 mg/100 g、IMP+AMP 0.5 mg/100 g and GMP 0.4 mg/100 g.Conclusion:The method which offers a new way to detect the nucleotides is simple,rapid and accurate and it can completely meet the detection of total nucleotides in infant formula food and milk powder.

formula food；milk powder；nucleotides；nucleosides；HPLC

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0048-05

2010-12-21

郝岩平（1960-），女，高级工程师，研究方向为乳品检测及食品安全。