新生大鼠缺氧/缺血性脑损伤时皮层神经元HIF-1α的表达与凋亡相关基因P53、Bcl-2的关系

王娟，张玉真，蒋犁

(东南大学医学院，江苏南京 210009)

缺氧/缺血性脑损伤(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致的胎儿或新生儿脑损伤，是新生儿时期最常见且严重的神经系统损伤［1］，至今仍无有效的治疗方法。HIBD过程中神经元损伤主要表现为坏死和凋亡，凋亡引起的损伤更严重［2］。缺氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor-1α，HIF-1α)是一种在缺氧应答过程中起重要作用的核转录因子。目前的研究结果显示，HIF-1α广泛参与各种细胞的凋亡过程［3］，但在新生大鼠脑组织中其与神经元凋亡的关系国内研究很少。研究表明，细胞凋亡过程受多种基因调控，P53和 Bcl-2被认为是凋亡的标志性基因［4－5］。因此，我们以新生7日龄SD大鼠HIBD模型为研究对象，观察HIBD伤后皮层HIF-1α的表达情况及其与P53和Bcl-2的关系，并与单纯缺氧组及假手术组比较，探讨新生大鼠脑HIBD时HIF-1α与神经元凋亡的关系。

1 材料和方法

1． 1 动物分组和模型建立

1．1．1 动物分组 新生7日龄SD大鼠，雌雄不限，体重11～16 g，由东南大学医学院实验动物中心提供。动物随机分为假手术组(n=6)、单纯缺氧组(n=30)和缺氧/缺血组(n=30)。单纯缺氧组和缺氧/缺血组按缺氧和缺氧/缺血后断头时间不同又分为3、6、12、24、72 h 5个亚组，每个亚组动物数相同(n=6)。

1．1．2 动物模型的建立 按照经典Rice方法［6］建立HIBD动物模型。SD大鼠经乙醚麻醉后取仰卧位固定，颈正中切口，假手术组仅分离右侧颈总动脉，不作任何处理;单纯缺氧组分离右侧颈总动脉，不结扎，仅作缺氧处理，方法同缺氧/缺血组;缺氧/缺血组分离并结扎右侧颈总动脉，缝合皮肤，术后回笼恢复2 h，然后放入缺氧容器中，充以湿化的92%氮气-8%氧气混合气体(1 L·min－1)2 h，回到常氧环境中恢复饲养。

1．1．3 标本采集 大鼠经10%水合氯醛(350 mg·kg－1)麻醉后，心脏灌注40 g·L－1多聚甲醛内固定，开颅将脑组织完整取出，放入40 g·L－1多聚甲醛固定3～7 d，选取视交叉到视丘的脑组织，厚约5 mm，经脱水透明包被后石蜡包埋切片，切片厚约6 μm，备用。

1． 2 HE 染色

石蜡组织切片经二甲苯及梯度酒精脱蜡水化处理后，HE染色10 min，自来水冲洗约10 min洗去多余的液体，盐酸酒精分化，镜下观察控制分化程度，自来水冲洗返蓝，放入95%乙醇数秒，伊红染色液染色2 min。脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察，细胞核呈蓝色，而细胞浆呈粉红色。

1． 3 HIF-1α、P53 和 Bcl-2 蛋白表达检测

将切片脱蜡，梯度酒精水化，3%双氧水封闭内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次，微波抗原修复后加山羊血清封闭20 min，弃去多余液体，分别加入抗HIF-1α大鼠多克隆抗体(1∶50)、P53鼠多克隆抗体(1∶100)、Bcl-2鼠多克隆抗体(1∶100)，4℃过夜。充分洗涤后，加生物素标记的抗大鼠IgG抗体(1∶100)孵育30 min，PBS洗涤3次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液37℃孵育1 h，充分洗涤，DAB显色，显微镜下控制反应颜色，自来水冲洗，终止显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察，阳性细胞显色为棕黄色。空白对照组不加抗HIF-1α大鼠多克隆抗体、P53鼠多克隆抗体、Bcl-2鼠多克隆抗体，其余步骤同前，均无阳性细胞表达。显微镜下观察HF-1α、P53和Bcl-2表达情况，取右侧大脑皮层3个视野，放大400倍，计算100个神经元中阳性染色的细胞数。

1． 4 统计学处理

2 结 果

2． 1 HE 染色结果

单纯缺氧组和缺氧/缺血组均可见不同程度的细胞胞体肿胀，气体样变，细胞稀疏，间隙增宽，细胞排列紊乱，结构不清，核固缩变圆，主要表现见于皮层和海马区，证实模型建立成功。单纯缺氧组细胞损伤程度较缺氧/缺血组轻，缺氧或缺氧/缺血损伤后24 h皮层神经元损伤最重，细胞溶解缺失明显。假手术组皮层神经元排列有序，细胞核大，胞浆少，见图1。

图1 缺氧后24 h各组皮层区HE染色 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 1 HE staining of cortex in brain tissues at 24 h after hypoxia in each group 10×40

2． 2 HIF-1α的表达和分布

假手术组脑组织HIF-1α蛋白仅有少量表达。单纯缺氧组和缺氧/缺血组皮层区HIF-1α在单纯缺氧或缺氧/缺血后表达增多(P＜0．05)，主要分布于皮层、海马等部位;单纯缺氧和缺氧/缺血后3 h HIF-1α开始出现表达，12 h达高峰，24 h后降低，72 h仍可见其少量表达。在同一时间点上，单纯缺氧组皮层区HIF-1α表达较缺氧/缺血组高，但差异无统计学意义。见表1、图2。

2． 3 P53和Bcl-2蛋白表达与分布

单纯缺氧组和缺氧/缺血组P53和Bcl-2主要分布于皮层和海马区。单纯缺氧组和缺氧/缺血组皮层区P53蛋白在单纯缺氧和缺氧/缺血后3 h表达增多，12 h表达明显，24 h表达达高峰，72 h表达仍较明显。高倍镜下P53蛋白表达强的细胞受损较重，形态变化明显。单纯缺氧组24 h时皮层区P53蛋白表达较缺氧/缺血组减少，差异有统计学意义(P＜0．05)。见表1、图3。

表1 大鼠单纯缺氧和缺氧/缺血后不同时间点皮层区HIF-1α、P53及Bcl-2阳性细胞表达情况Tab 1 Comparison of positive cell of HIF-1α、P53 and Bcl-2 in cortex after hypoxia or hypoxia ischemia in neonatal rats

表1 大鼠单纯缺氧和缺氧/缺血后不同时间点皮层区HIF-1α、P53及Bcl-2阳性细胞表达情况Tab 1 Comparison of positive cell of HIF-1α、P53 and Bcl-2 in cortex after hypoxia or hypoxia ischemia in neonatal rats

与假手术相比较，a P＜0．05;与同组内前一时间点比较，b P＜0．05;与单纯缺氧组同一时间点比较，c P＜0．05

组 别 n HIF-1α阳性细胞数 P53阳性细胞数 Bcl-2阳性细胞数 P53/Bcl-2值10．5 ±1．52 7．0 ±2．45 6．8 ±2．26 1．03单纯缺氧组3 h 6 21．5 ±2．51a 15．83 ±2．48a 18．17 ±2．13a 0．87 6 h 6 28．83 ±2．64ab 19．5 ±1．87ab 25．0 ±3．03ab 0．78 12 h 6 34．83 ±1．94ab 27．33 ±2．94ab 33．67 ±2．50ab 0．81 24 h 6 28．0 ±1．79ab 28．5 ±2．74a 23．0 ±3．16ab 1．24 72 h 6 23．83 ±1．72ab 23．5 ±2．43ab 22．33 ±4．72a 1．05缺氧/缺血组3 h 6 18．5 ±2．17a 18．83 ±1．72ac 21．17 ±2．93a 0．89 6 h 6 24．83 ±1．72abc 22．33 ±2．42ac 25．0 ±2．90ab 0．89 12 h 6 31．83 ±4．53ab 31．17 ±2．78ab 36．0 ±2．61ab 0．87 24 h 6 25．6 ±2．06ab 35．5 ±1．64abc 28．1 ±2．14abc 1．26 72 h 6 21．17 ±2．32abc 28．6 ±2．25abc 24．67 ±1．75a假手术组6 1．16

图2 缺氧后12 h各组皮层区HIF-1α的表达 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 2 Expression of HIF-1α at 12 h after hypoxia in cortex in each group 10×40

图3 缺氧后24 h各组皮层区P53的表达 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 3 Expression of P53 at 24 h after hypoxia in cortex in each group 10×40

假手术组脑组织Bcl-2蛋白阳性表达低，单纯缺氧组和缺氧/缺血组皮层区Bcl-2蛋白在单纯缺氧或缺氧/缺血后3 h表达增多，12 h达高峰，24 h后逐渐下降，72 h仍有少量表达。高倍镜下Bcl-2显色深的细胞形态较为正常，细胞核完整。单纯缺氧组12 h时皮层区Bcl-2蛋白表达较缺氧/缺血组减少，但差异无统计学意义(P ＞0．05)。见表1、图4。

图4 缺氧后12 h各组皮层区Bcl-2的表达 10×40A．sham group;B．hypoxia group;C．hypoxia ischemia groupFig 4 Expression of Bcl-2 at 12 h after hypoxia in cortex in each group 10×40

2． 4 HIF-1α与P53、Bcl-2表达的相关性分析

HIF-1α阳性细胞数与P53阳性细胞数表达呈正相关(单纯缺氧组 r=0．589，P ＜0．01;缺氧/缺血组r=0．531，P ＜0．01);HIF-1α 阳性细胞数与 Bcl-2 阳性细胞表达呈正相关(单纯缺氧组r=725，P＜0．01;缺氧/缺血组 r=0．811，P ＜0．01)。假手术组 P53/Bcl-2值约等于1，单纯缺氧组和缺氧/缺血组3、6和12 h这3个时间点上P53/Bcl-2值小于1，单纯缺氧组和缺氧/缺血组24 h和72 h这两个时间点上P53/Bcl-2值大于1。

3 讨 论

在生理和病理状态下，细胞或机体对缺氧的适应能力对其存活十分重要。目前研究已证实:当组织或细胞缺氧时会发生不同程度的细胞凋亡。HIF-1是一种在维持氧平衡中起重要作用的转录调节因子［7］，由α和β亚单位组成，其中α是活性单位，β是结构单位。在常氧下HIF-1α是一种极不稳定的蛋白，主要由细胞内的泛素蛋白酶将其降解，其半衰期不超过5 min。当低氧时，泛素蛋白酶的活性受抑制，HIF-1α稳定性增加，与HIF-1 β形成异二聚体，结合到核DNA序列，引起多种靶基因的转录激活，如促红细胞生成素、糖酵解酶、血管内皮生长因子等［8］。

本研究结果显示，HIF-1α表达主要分布于皮层和海马等部位，在单纯缺氧和HIBD中其表达具有时间规律性，即在单纯缺氧或缺氧/缺血3 h后皮层区HIF-1α出现表达增加，12 h达高峰，以后其表达量呈下降趋势。我们推测，单纯缺氧或缺氧/缺血使HIF-1α稳定性增加，其表达也随之增加，但随着复氧时间的延长，缺氧程度减轻，泛素蛋白酶活性增强，加速HIF-1α降解，使其表达减少，因而表现为先升后降的趋势。在正常组织中，促凋亡与抗凋亡维持在一定的动态平衡中。我们的实验结果显示，假手术组大鼠脑组织P53/Bcl-2值约等于1，也就是说在正常脑组织中P53和Bcl-2维持着平衡，而当细胞受到凋亡等信号刺激，此平衡被打乱，相应的促凋亡基因表达增多，抗凋亡基因表达相对减少，反之亦然［3］。单纯缺氧组或缺氧/缺血组在3、6、12 h这3个时间点上P53/Bcl-2值小于1，单纯缺氧组或缺氧/缺血组在24 h和72 h这两个时间点上P53/Bcl-2值大于1，也就是说在3、6和12 h这3个时间点上细胞主要以抗凋亡为主，24 h和72 h这两个时间点上主要以促凋亡为主。我们认为，这可能与HIF-1α表达下降导致Bcl-2表达减少有关。因此，我们推测，在新生大鼠脑HIBD中，HIF-1α在缺氧损伤早期可能具有抗凋亡作用，与Fan等［9－10］关于HIF-1α在新生大鼠HIBD的研究结果是一致的，提示在HIBD早期自我保护机制启动，这给临床医师快速干预提供了时间窗。但本实验仅从HIF-1α与P53和Bcl-2的表达上进行分析，尚未涉及对HIF-1α的干预研究，对此，仍需进行进一步的实验研究。

［1］FERRIERO D M．Neonatal brain injury［J］．N Engl J Med，2004，351(19):1985-1995．

［2］HAGBERG H，MALLARD C，ROUSSET CI，et al．Apoptotic mechanisms in the immature brain:involvement of mitochondria［J］．J Child Neurol，2009，24(9):1141-1146．

［3］杨月霞，黄文新．HIF-1在缺血缺氧性疾病中的研究进展［J］．山西医药，2010，50(20):111-114．

［4］XU F L，ZHU C L，WANG X Y，et al．Expression of p53 in neonatal mice following hypoxia-ischemia and effects of its inhibitor on neonatal brain injury［J］．Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2006，8(2):137-140．

［5］ZHUO P H，XIONG Y，QIN L，et al．Expression of bcl-2 protein and apoptosis of neurocytes in neonatal rats with brain white matter damage［J］．Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi，2007，9(2):164-168．

［6］RICE J E 3rd，VANNUCCI R C，BRIERLEY J B．The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rats［J］．Ann Neurol，1981，9(2):131-141．

［7］赵小祺，王春光，王小荣，等．缺氧诱发细胞凋亡的机制［J］．中国老年学杂志，2010，7(30):1012-1014．

［8］MU D，JIANG X，SHELDON R A，et al．Regulation of hypoxia-inducible factor 1alpha and induction of vascular endothelial growth factor in a rat neonatal stroke model［J］．Neurobiol Dis，2003，14(3):524-534．

［9］FAN X，HEIJNEN C J，van DERKOOIJ M A，et al．The role and regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha expression in brain development and neonatal hypoxia-ischemia brain injury［J］．Brain Res Rev，2009，62(1):99-108．

［10］ SHELDON R A，OSREDKAR D，LEE C L，et al．HIF-1alpha-deficient mice have increased brain injury after neonatal hypoxia-ischemia［J］．Dev Neurosci，2009，31(5):452-458．