雌激素受体α基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性与子痫前期相关性研究
2011-01-06汤琳琳徐友娣薛鑫源韩云
汤琳琳,徐友娣,薛鑫源,韩云
(南京医科大学附属南京第一医院妇产科,江苏南京 210006)
子痫前期(preeclampsia,PE)是危及母婴健康的妊娠期特发性疾病,其发病机制至今尚未阐明。血管内皮损伤是目前公认的PE一系列病理生理反应的基础。而雌激素为天然的血管保护剂,能改善内皮细胞功能,抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移,降低血脂,改善血流动力学参数,起到扩血管、抗炎、抗增生等血管保护作用[1]。在人体内,雌激素通过与其特异性受体——雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合来调节一系列基因的表达,进而发挥其重要生理作用。研究已发现,ER基因多态性与冠心病密切相关[2],而 PE亦有血管内皮损伤这一基本过程,因此提出,ER基因多态性与PE具有密切的关系。既往ER的研究大部分集中在 ERα的遗传多态性方面[2-3],本研究亦选择ERα基因。通过从全血中提取DNA,运用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测PE患者与健康孕妇在ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ两个酶切位点的多态性,探讨PE的发生与ER基因多态性之间的关系及不同病变程度的PE与其多态性之间的关系,为今后进一步研究PE的发病机制奠定基础,也为今后临床上的早期诊断、干预性治疗和寻找药物作用靶点阐明理由。
1 资料与方法
1. 1 临床资料
按文献[4]标准,选取2008年7月至2010年2月在我院产科住院的135例诊断为PE的患者为研究对象(PE组),组内进一步分为轻度PE组(n=64)和重度PE组(n=71);选取同期住院的122例年龄、孕周与实验组均无统计学差异的正常孕妇为对照组。所有孕妇均为初产妇,无其他合并症和慢性病史,研究对象符合Hardy-Weinbery平衡定律。
1. 2 研究方法
1.2.1 DNA提取 取全血3 ml,选用美国OMEGA公司提供的全血DNA试剂盒,提取基因组DNA后,置-80℃保存备用。
1.2.2 PCR检测 限制性内切酶 PvuⅡ和 XbaⅠ酶切位点相近,XbaⅠ与P位点相距50 bp。本实验ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠPCR扩增产物为同一段包括第1内含子和部分第2外显子,长度1.3 kb的DNA片断。PCR引物设计如下:上游引物序列为5'-CTGCCACCCT ATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3',下游引物序列为5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3',引物由上海英骏生物技术有限公司合成。总反应体系50 μl,组成如下:PCR Master Mix(2 × )25 μl,上游引物 1.0 μl,下游引物 1.0 μl,模板 DNA 3.0 μl,灭菌水20 μl。混匀后按下列循环扩增:94℃预变性5 min,94 ℃ 变性30 s,55 ℃ 退火 40 s,72 ℃ 延伸 90 s,72 ℃保温延伸10 min,共35个循环。取PCR产物10 μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳35 min,经溴化乙锭染色及凝胶系统成像后观察特异性条带,为1 300 bp。
1.2.3 RFLP检测 ERα基因PCR产物分别与限制性内切酶PvuⅡ及XbaⅠ混合,水浴37℃过夜。成分如下:PCR 产物 10 μl,PvuⅡ或 XbaⅠ1.0 μl,10 × buffer G 2.0 μl,灭菌双蒸馏水 17 μl。取各自酶切产物行经溴化乙锭染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳。
ERα基因的PCR扩增产物为1.3 kb,经PvuⅡ限制酶水解后可得到3种基因型(含PvuⅡ酶切位点的等位基因记为“p”,无酶切位点的记为“P”),即pp型(850 bp+450 bp)、Pp型(1 300 bp+850 bp+450 bp)、PP型(1 300 bp)。同样,ERα基因的PCR扩增产物经XbaⅠ限制性内切酶水解后可得到3种基因型:xx型(900 bp+400 bp);Xx型(1300 bp+900 bp+400 bp);XX型(1300 bp)。
1. 3 统计学处理
研究数据均采用SPSS 13.0统计软件进行分析,基因型和等位基因频率采用基因计数法计算,基本资料以x±s表示,采用t检验,两组基因型分布频率及等位基因表型频率的比较,采用R×C列联表和四格表χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 临床资料比较
见表1。
表1 PE组及对照组的基本资料
PE组和对照组之间及PE组组内孕妇年龄、孕周比较差异无统计学意义。PE组与对照组之间的收缩压和舒张压均差异有统计学意义(P<0.05),PE组内轻度PE收缩压、舒张压及24 h尿蛋白显著低于重度PE(P <0.05)。
2. 2 ERα基因PvuⅡ及XbaⅠ酶切结果
见图1。
图1 ER α基因多态性PvuⅡ及XbaⅠ酶切电泳图
2. 3 PE组与对照组ERα-PvuⅡ的基因多态性
见表2、3。
由表2可见,PE组与对照组之间ERα-PvuⅡ基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=5.117,P=0.077),而等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=4.756,P=0.029)。由表3 可见,PE 组组内轻度PE与重度PE的ERα-PvuⅡ基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(χ2=1.644,P=0.440;χ2=0.442,P=0.506)。
2. 4 PE组与对照组ERα-XbaⅠ的基因多态性
见表4、5。
由表4、5可见,PE组与对照组之间及轻度PE与重度PE的ERα-XbaⅠ基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。
3 讨 论
国内外关于ERα基因PvuⅡ及XbaⅠ多态性与妊娠期高血压或PE关系的研究结果各一。早期向若兰等[5]研究发现,妊娠期高血压疾病组PP基因频率、P等位基因频率明显高于对照组(P<0.01);妊娠期高血压疾病组与其对照组X和x等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.01)。ER的PvuⅡ及XbaⅠ基因多态性与妊娠期高血压疾病相关,二者都是其发病的独立危险因素,PvuⅡ基因多态性与妊高征的相关程度较强,XbaⅠ基因多态性与妊娠期高血压疾病的相关程度较弱。德国Tempfer等[6]的一个小样本多基因病例对照研究结果表明,ERα基因PvuⅡ多态性并非重度PE的独立危险因素,但可能参与构成重度PE的多基因发病机制。Molvarec等[7]研究发现,重度PE与雌激素受体α基因PvuⅡ及XbaⅠ的多态性均无相关性。Zhang等[8]研究结果亦表明,PE组与对照组之间雌激素受体α基因PvuⅡ或者XbaⅠ在基因型和等位基因频率分布之间无明显相关性,且轻度PE和重度PE之间亦无明显相关性。
表2 PE组与对照组ERα-PvuⅡ的基因多态性统计结果
表3 PE组内ERα-PvuⅡ的基因多态性统计结果
表4 PE组与对照组ERα-XbaⅠ的基因多态性统计结果
表5 轻度PE与重度PE组间的ERα-XbaⅠ基因多态性统计结果
本研究通过对南京地区135例的PE患者(其中64例为轻度,71例为重度)与122例正常孕妇进行研究,发现ERα基因PvuⅡ酶切位点多态性与PE的发生存在一定的相关性,P等位基因可能是其危险因素,但与PE的病变程度无明显关联。ERα基因XbaⅠ酶切位点的基因多态性与PE的发生及其病变程度均无明显相关。
雌激素必须与靶组织细胞浆或核内ER结合才能发挥作用。因此,雌激素受体的结构和功能直接影响到雌激素的作用效果。根据本研究结果,推测ERα基因P等位基因的出现改变了ERα的表型,从而降低了雌激素与其结合后的效用,故血管内皮易受损伤,易致PE的发生。而PE的病变程度则由其他因素决定,如血管活性物质等。
ERα基因多态性与PE相关性的研究结果目前国内外有较大的差异,甚至完全相反。考虑可能与人群、种族、地域或样本量有关,也可能某些基因虽未发生突变,但其基因活性的改变与发病相关,同时PE是一种多因素疾病,属遗传易感性疾病,是遗传因素与环境因素共同作用的结果。探求PE的发病原因以及将研究成果应用于临床以筛选PE高危人群,需要更大规模的、多方面的、多地域的、多民族的流行病学和进一步的实验室研究。
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[7]MOLVAREC A,VÉR A,FEKETE A,et al.Association between estrogen receptor alpha(ESR1)gene polymorphisms and severe preeclampsia[J].Hypertens Res,2007,30(3):205-211.
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