黑龙江汉族速滑运动员优秀耐力能力与肌型肌酸激酶基因（CKMM）A/G多态的关联研究

周文婷，李丽文，刘向宇

（1.哈尔滨体育学院 运动人体科学系，黑龙江 哈尔滨 150008；2.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030）

肌酸激酶（CK）是一个与细胞内能量运转，肌肉收缩，ATP再生有直接关系的重要激酶［1-2］，它可逆地催化肌酸（Cr）与ATP之间的转磷酰基反应，是该反应的关键酶。CK与磷酸肌酸（PCr ）组成肌酸-磷酸肌酸穿梭系统，可作为细胞内“暂时的能量缓冲系统”，用以在高能量需求时维持细胞内的ATP/ADP比率［3］；同时作为能量转运单位, 该系统亦作用于将能量从产生部位转运至利用部位。CK有4种同工酶形式，分别为肌肉型（MM）、脑型（BB）、杂化型（MB）和线粒体型（MiMi），其中CKMM主要表达于骨骼肌中，在心肌中也有少量表达。肌肉中CKMM主要集中在M线附近［4］，主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及运动供能。此外，CKMM在肌质网（SR）Ca2+ ATP酶的附近也有表达［5］，作用可能涉及Ca2+的再聚集［6］，进而影响肌肉的工作能力。

人的CKMM基因位于染色体的19q13.2～q13.3区域，长度约有17.5 kb，包含8个外显子和7个内含子。研究表明，在CKMM基因3′端非编码区存在可能与耐力有关的CKMM-NcoⅠ多态位点，且该位点在我国北方汉族人群中的分布与欧美人群相比具有非常显著性差异［7］；在对耐力训练效果与该位点多态间的关系进行研究后发现，CKMM基因与跑节省化（RE）指标有关, 该位点不同基因型携带者对耐力训练的敏感性具有显著性差异［8］，而该位点与个体50W负荷时心脏收缩功能对耐力训练的敏感性亦存在关联［9］，从而提示该位点可能与我国北方汉族人的耐力训练效果相关，这对于了解运动训练中个体差异的产生原因，科学制定个性化训练方案提供了理论依据。

黑龙江省是冰雪运动大省，各种冰雪项目，尤其是速滑项目在国际上享有盛誉。黑龙江省冰雪项目运动员作为国家队队员的主要后备力量，其选材历来备受瞩目，具有优秀的耐力素质的耐力型速滑运动员更是选材的重点。然而，当前CKMM基因NcoⅠ位点多态性的关联研究后继乏力，对其适用性尚无更多佐证。故本研究对黑龙江籍汉族优秀耐力型速滑运动员的CKMM-NcoⅠ位点多态分布进行探索，旨在探寻该多态位点分布与速滑运动员优秀耐力素质间的关联性，为进一步开展群体遗传学和体育科学研究提供有益的资料。

1 实验对象与方法

1.1 实验对象

健康大学生120例，其中男性82人，女性38人，所有研究对象均为黑龙江籍汉族，彼此无血缘关系，受试者基本情况见表1。优秀耐力项目速滑运动员25例，其中男性11人，女性14人，均为黑龙江籍汉族，彼此无血缘关系，基本情况见表2。

表1 大学生受试者基本情况

表2 速滑运动员基本情况

1.2 实验方法

取静脉血2mL，2%EDTA抗凝，分离白细胞，-20℃保存。采用Promega公司试剂盒提取基因组DNA。PCR-RFLP法解析NcoⅠ位点基因型，PCR扩增引物序列如下：

F:GGGATGCTCAGACTCACAGA；R:AACTTGAATTTAGCCCAACG。

PCR反 应 体系为：PCR反 应 buffer 2μL，1.5mmol/LmgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol/L，上、下引物各0.5μmol/L，Taq酶1U，模板100ng，无菌水补足至20μL。

PCR反应参数为：94 ℃预变性7min，94 ℃变性40s，50℃退火40s，72 ℃延伸60s，30个循环，最后72 ℃延伸10min。取5μL扩增产物在2%琼脂糖中进行电泳，90V 40min检验扩增效果。

取PCR扩增产物7 μL、限制性内切酶NcoⅠ1μL（8 U）、10×缓冲液2 μL和0.1% BSA 2 μL于37 ℃酶切8 h。酶切产物以3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统紫外光成像。

1.3 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。以χ2检验计算基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。采用r×c列联表卡方检验计算与其他人群的基因型分布差异。检验显著性水平定为P ＜ 0. 05，非常显著性差异定为P ＜ 0. 01。

2 结果与分析

CKMM基因经PCR及NcoⅠ内切酶消化以后得到3种条带：有酶切位点的纯合型有153 bp /206 bp 两条带，没有酶切位点的纯合型只有359 bp 1条带，而杂合型有153 bp /206 bp + 359 bp 3条带，其中153 bp + 206 bp /153 bp + 206 bp 是A/A纯合型，359 bp/359 bp是G/G纯合型，153 bp + 206 bp/359 bp是A/G杂合型。

3种基因型在健康大学生及耐力型速滑运动员中的分布经卡方检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律( P ＞ 0. 05)，具有群体代表性。不同性别受试者在NcoⅠ位点的基因型和等位基因分布频率均无显著性差异，与周多奇等［7］研究结果相似，表明黑龙江籍汉族人在该位点与所涉地域更广的我国北方汉族人多态分布相近，具有典型的北方汉族群体遗传特征，具体分布见表3。

表3 黑龙江汉族大学生及耐力型速滑运动员CKMM 基因NcoⅠ位点多态性分布

与加拿大、西班牙和意大利人群相比，包括黑龙江在内的我国北方汉族人及黑龙江耐力型速滑运动员在该位点的等位基因频率和基因型频率与他们均有非常显著性差异（P ＜ 0. 01），而与韩国人相比，基因型频率和等位基因频率差异均不显著。在对其他种族间数据进行比较后发现，韩国人与各欧美人群在等位基因频率和基因型频率上均呈显著性差异（P ＜ 0.05），而欧美各国人群组间则均无显著性差异（见表4）。

表4 不同种族人群CKMM 基因NcoⅠ位点多态性分布

个体间体质和运动能力的差异受多种因素影响，其中环境（运动训练、营养与技术方法）和遗传因素在很大程度上起决定作用。而在相同的环境下，不同的遗传背景可能是影响个体间不同体质、不同运动能力的主要原因。1998年Montgomery等［16］对血管紧张素转化酶基因ACE进行的划时代研究开启了运动能力相关基因多态研究的新领域。随着生物技术与分子遗传学的进一步发展，迄今已有包括214个常染色体基因位点、7个X染色体位点和18个mtDNA序列多态性位点在内的，与人类体质和优秀运动能力有关的基因位点被发现和定位［17］，其中有关耐力素质的研究较多，发现也较集中，极大丰富了人们对不同种族、不同地域人群体质和运动能力差异性原因和机制的认识，也更好地促进了群体遗传学的发展。作为运动能力的重要组成部分，耐力素质是多基因控制的复杂表型。有人研究了多个代谢基因对耐力运动员体型、慢肌纤维比例及最大氧消耗量的综合作用，发现了10个与耐力相关的基因多态型，而这些基因多态型在运动员中表达的数量越多，运动员的慢肌纤维比例越高，氧消耗量越大，耐力素质也越好［18］。随着高通量SNP分析技术的应用，更快更方便的全基因组测序技术的发展，基因间的微小、多重、积累的相互作用将被检测，“运动基因”的探寻进程有望加快，通过分子技术进行优秀运动员选材的愿望将更快实现［19］。

CKMM基因NcoⅠ多态性是除ACE基因I/D多态性、ACTN3基因rs540874多态性外，已报道的可能与耐力运动能力和耐力训练敏感性相关的多态位点，其中杂合型A/G携带者被认为可能具有更高的耐力水平和更高的训练敏感性［7，20-21］，周多奇等［7-9］对我国北方汉族人耐力训练敏感性的研究也对此也予以了证实。然而，CKMM基因NcoⅠ位点多态性的应用性研究后继乏力，冰雪项目更是从未涉及，故本文首次对冰雪项目运动员的优秀耐力素质与该位点的关联性进行了探索。结果发现，黑龙江籍汉族人中A/G基因型的频率为22%，与我国北方汉族人（24%）中该基因型频率相似，与韩国人（31%）相比差异也不显著（P＞0.05），但与欧美各国人相比，其分布频率非常显著低于各国（35%～54%）（P＜0.01）；而在韩国人中，其分布频率也显著低于欧美各国（P＜0.05），欧美各国人间其分布频率则无显著性差异（P＞0.05），表明CKMM基因NcoⅠ多态性可能存在种族及地域上的显著差异，而这或许正是亚洲地区与欧美地区人群间存在较大体质和耐力水平差异的原因之一。此外，研究还发现，黑龙江优秀耐力型速滑运动员中A/G基因型的频率为32%，略高于包括黑龙江省在内的我国北方汉族人中该基因型的频率（22%及24%），与韩国人（31%）结果非常相似（P＞0.05），无显著性差异，表明黑龙江汉族耐力型速滑运动员在CKMM基因NcoⅠ多态位点的分布与优秀耐力素质无关，该位点不能作为其耐力素质选材的遗传学标记，速滑运动员的优秀耐力素质更多受到其它环境因素（运动训练、营养与技术方法）的影响。当然，由于实验设计及研究样本量所限，很多研究都可能出现结论的相悖，然而随着后基因组计划及群体遗传学的的深入开展，相信大量的遗传学信息将会逐渐弥补这些缺憾，而本研究也将在未来进一步加大样本含量，以期更准确地描述该基因多态位点的分布特征。

3 结论

综上，研究首次对黑龙江汉族耐力型速滑运动员在CKMM基因NcoⅠ位点的多态分布进行了检测，结果发现，等位基因频率分别为A=84%和G=16%，基因型频率分别为A/A=68%、A/G=32%，基因型和等位基因频率在男性和女性间无显著性差异（P＞0.05），与欧美人群相比频率差异具有显著性（P＜0.05），而与包括黑龙江省在内的我国北方汉族人及韩国人相比差异不显著（P＜0.05），故该位点不能作为其耐力素质选材的遗传学标记。虽然如此，研究对我国北方汉族人，尤其对黑龙江汉族优秀运动员在CKMM基因NcoⅠ位点的多态分布信息进一步予以了补充，为后续更加深入的群体遗传学研究和运动能力的分子生物学研究亦提供了有用的资料。

［1］Lehninger AL. Bioenergetics［M］. 2nd.Benjamin:menlo Park, 1977: 67-77.

［2］Seraydrarianm W & Abbot BC. The role of the creatine phosphokinase system inmuscle［J］. Jmol Cell Cardiol, 1976 (8): 741-746.

［3］Saks VA, Rosenshtraukh LV, Sgmirnov VN, et al. Role of Creatine Phosphokinase in Cellular Function andmetabolism［J］. Can J Physiol Pharmacol, 1978, 56 (5): 691-706.

［4］Turner DC,Wallimann T, Eppenberger HM. A protein that Binds Specifically to them-line of Skeletalmuscle is Identified as themuscle Form of Creatine Kinase［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1973, 70: 702-705.

［5］Korge P, Camphcil KB. Local ATP Regeneration is Important for Sarcoplasmic Rcticulum Ca2+Puinp Function［J］. Am J Physiol, 1994, 267:C357-C366.

［6］Steeghs K, Oerlemans F, Haan A, et al.Cytoarchitectural and metabolic Adaptations in muscles with mitochondrial and Cytosolic Creatine Kinase Deficienciesmol Cell［J］. Biochemistry,1998, 184: 183-194.

［7］周多奇, 胡扬, 刘刚, 等. 中国北方汉族人群肌型肌酸激酶基因(CKMM) A/G多态研究［J］.遗传, 2005, 27 (4): 535-538.

［8］周多奇,胡扬,刘刚, 等.耐力训练效果与CKMM基因A/G多态性的关联研究［J］.体育科学, 2006, 26 (7): 63-67.

［9］周多奇, 胡扬, 刘俊, 等.耐力训练对心脏结构及功能的影响与CKMM基因A /G多态性的关联研究［J］.成都体育学院学报, 2008, 34 (2):76-80.

［10］Riveram A, Dionne FT, Simoneau JA, et al.muscle-specific creatine kinase gene polymorphism and VO2max in the Heritage family study［J］.med Sci Sports Exerc, 1997,29: 1311-1317.

［11］Riveram A, Perusse L, Simoneau JA, et al.Linkage between amuscle-specific CK genemarker and VO2max in the HER ITAGE family study［J］.m ed Sci Sports Exerc, 1999, 31:698-701.

［12］Riveram A, Dionne FT, Wolfarth B, et al.muscle-specific creatine kinase gene polymorphisms in elite endurance athletes and sedentary controls［J］.m ed Sci Sports Exerc,1997, 29: 1444-1447.

［13］Lucia A, Gomez-Gallego F, Chicharro JL, et al.Is there an association between ACE and CKMM polymorphisms and cycling performance status during 3-week races［J］. Int J Sportsmed,2005, 26: 442-447.

［14］Gennarellim, Novelli G, Cobo A, et al.3′creatine kinase (M-type) polymorphism linked tomyotonic dystrophy in Italian and Spanish populations［J］. Hum Genet, 1991, 87:654-656.

［15］Byung YK, Chin YK, Kang OL.muscle-specific creatine kinase gene polymorphisms in korean elite athletes［J］. J Toxicol Pub Health, 2003,19: 115-121.

［16］Montgomery HE,marshall R, Hemingway H, et al. Human gene for physical performance［J］.Nature, 1998, 393:221-222.

［17］BraymS, Hagberg JM, Pérusse L, et al. The Human Genemap for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes: The 2006-2007 Update［J］.med Sci Sports Exerc, 2009, 41 (1):35-73.

［18］Ahmetov II, Williams AG, Popov DV, et al. The combined impact of metabolic gene polymorphisms on elite endurance athlete status and related phenotypes［J］. Human Genet,2009.

［19］Trent RJ, Yu B. The future of genetic research in exercise science and sportsmedicine［J］.med Sport Sci, 2009, 54: 187-195.

［20］Riveram A, Perusse L, Simoneau JA, et al.Linkage between a muscle-specific CK genemarker and VO2max in the HER ITAGE family study［J］.m ed Sci Sports Exerc, 1999, 31:698-701.

［21］Lucia A, Gomez-Gallego F, Chicharro JL, et al.Is there an association between ACE and CKMM polymorphisms and cycling performance status during 3-week races［J］. Int J Sportsmed,2005, 26: 442-447.