bBMP 异位诱导成骨的组织学长期观察

李丹，毕龙，刘民，金静，吕荣，王军，白建萍，吴拮，李静，刘崟，胡蕴玉

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是迄今为止所发现的作用最为肯定的骨诱导因子。自1965年Urist[1]首次报道骨形态发生蛋白具有异位成骨能力后，关于BMP的研究和应用就从未停止，无论是从生物提取 BMP 到基因重组人BMP，还是从动物实验到临床应用均取得了巨大的成功。但是，关于BMP 仍有许多没有解决的问题，例如 BMP 活性定量，BMP 异位成骨的转归等。目前，研究主要集中在基因重组的BMP，如rhBMP-2、rhBMP-4 及rhBMP-7等，反而忽视对最早通过生物化学方法提取并纯化的天然 BMP的研究。既然 BMP 具有强大的异位骨诱导成骨能力，这种异位生成骨是否具有应用价值？其转归如何？本实验就小牛骨中生物提取 BMP 异位成骨过程中组织学的变化进行长期观察，了解成骨骨质变化情况，探讨这种异位生成骨进一步应用的可能性，并为BMP 相关骨修复研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 bBMP 由本研究所综合骨库制备[2]；速眠新为长春军事兽医研究所提供；戊二醛（进口分装）为上海化学试剂采购供应站提供；染色液为本研究所骨科实验室（全军重点实验室）病理室配制。

1.1.2 仪器 Leica 1516 切片机和Leica DM LA型显微照相系统均为德国 Leica公司产品。

1.1.3 实验动物 昆明小鼠，雄性，6周龄，体重（20±2）g，购自第四军医大学实验动物中心，质量合格证号：SCXK（军）2007-007。

1.2 方法

1.2.1 植入实验 昆明小鼠 21只，麻醉后于双侧股部肌肉中直接植入块状 bBMP 各 2 mg，分别于第 1、2、4、6、8、10、12周各处死 3只，切取诱导分化组织，5% 戊二醛固定。

1.2.2 组织切片与染色 固定的标本常规方法石蜡包埋，连续切片，厚度 5 μm，分别行甲苯胺蓝染色，HE 染色，丽春红三色染色。

2 结果

bBMP 植入 1周，甲苯胺蓝染色和HE 染色均显示大量分化良好的间充质细胞、幼稚软骨细胞及成熟的肥大软骨细胞生成，分化组织形成一椭圆形组织块，甲苯胺蓝染色显示软骨基质呈典型的蓝紫色（图 1A）；植入 2周，大量骨小梁生成，骨小梁中散在分布大量成骨细胞，骨小梁呈不规则的条索状，中轴部分尚残存软骨基质，周边部分为新生的类骨质或骨质，HE 染色呈粉红色（图 2B），丽春红三色染色显示骨小梁新生的骨组织类骨质呈深蓝色，未见染成红色的成熟骨质（图 3B），甲苯胺蓝染色软骨基质淡染；植入 4周，骨小梁转化为成熟的骨质（图 2C，图 3C），骨细胞及骨陷窝形成，甲苯胺蓝染色显示软骨基质的蓝紫色失染，表明软骨化骨，已无软骨基质分泌；骨小梁间有骨髓腔和骨髓样物质形成；从 4周开始骨质中有散在于骨细胞中的破骨细胞出现；植入 6～12周，椭圆形骨组织块内部小梁骨逐渐吸收、断裂、不连接，但外周骨质逐渐塑形，骨细胞层状排列，丽春红三色染色显示红色骨质周边有蓝色的新生骨形成（图 3E、F、G）。

图1 1～12周 bBMP 异位诱导成骨情况的甲苯胺蓝染色×200 图 2 1～12周 bBMP 异位诱导成骨情况的HE 染色观察×100 图 3 1～12周 bBMP 异位诱导成骨情况的丽春红三色染色×200Figure1 1 - 12 weeks histologic sections of ectopic bone induced by bBMP toluidine blue-stained×200 Figure 2 1 - 12 weeks histologic sections of ectopic bone induced by bBMP hematoxylin and eosin-stained×100 Figure 3 1 - 12 weeks histologic sections of ectopic bone induced by bBMP Masson trichrome-stained×200

3 讨论

BMP是转化生长因子（TGF-β）超家族成员，广泛分布于动物骨组织，是一种酸性糖蛋白。现已在人基因组中发现 BMP 家族有 20 多个成员，是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，对骨组织的形成、骨的生长及骨损伤修复具有促进作用[3]。现有的研究大多集中在BMP 对骨修复的促进方面，与某些材料复合或作为构建组织工程骨必不可少的生长因子。之所以学者们热衷于此，正是因为骨移植替代物的短缺或者美中不足，即使临床已经应用的替代物如自体骨、异体骨及各种人工骨和一些初步临床应用的个体化设计的组织工程骨均不同程度存在诸如取骨量有限、存在潜在病毒感染、免疫排斥反应、新骨形成和材料降解不匹配等诸多问题。因此，有学者开始考虑能否利用 BMP 异位骨诱导作用将异位生成骨用于骨移植[3-5]。

Kusumoto等[6]以 I 型胶原为rhBMP-2 载体在Wistar 大鼠肌肉中异位预制了血管化的骨组织，Inoda等[7]以胶原海绵为rhBMP-2 载体于Wistar 大鼠肌肉中异位构建骨组织，3周时用于修复骨缺损，并与自体骨、异体骨进行了比较，实验结果令人满意。然而 Cooley等[8]对 rhBMP-2 异位成骨进行的长期观察研究表明，这种皮下或肌肉注射 rhBMP-2 所诱导生成的异位骨与在骨性组织中长期存在的新生骨不同，异位成骨是短期成骨，异位新生骨会发生吸收，在4周时完全丧失钙化特征，在其设计的9组实验中，除 4组皮瓣组外，其他 5组新生骨在4～5周时均全部消失。本实验直接将从小牛皮质骨中提取的天然 BMP（二次纯化离心所得的块状沉淀）未加任何载体，单独植入小鼠股部肌肉中发现，如 rhBMP-2 一样，1周时即诱导大量软骨细胞生成，2周时大量骨小梁生成，不同的是，因块状 bBMP 向四周募集间充质细胞向软骨细胞分化从而形成一不规则的椭圆形组织块；4周时，bBMP 所诱导的异位椭圆形骨组织最外层骨小梁塑形连接转化为成熟骨质，骨细胞及骨陷窝形成，甲苯胺蓝染色显示软骨基质的蓝紫色失染，表明软骨化骨，已无软骨基质分泌，内部骨小梁虽也由新生骨转化为成熟骨质，但骨小梁不如 2周时致密，6～12周，椭圆形组织块内部仍残存部分骨小梁，但明显稀疏、断裂、不连接，外层骨质却未见明显吸收。

Jingushi等[9]以 βTCP 作为rhBMP-2 载体在体内肌肉中异位构建血管化的自体骨，结果表明，血管化在异位骨的形成和维持中起着至关重要的作用。本实验椭圆形组织块内骨小梁在4周以后开始吸收，而周边骨质 12周时仍未见有明显吸收，相反，骨质塑形，骨小梁周边仍可见到新生骨生成。本实验直接异位植入块状 bBMP，诱导形成的椭圆形组织块外周被肌肉所包绕，有着丰富的血供，骨质未见明显吸收，而组织块内部，由于没有载体支架，血管长入困难，血供差，骨小梁逐渐吸收降解，提示血供在异位骨的形成和维持中可能起着重要作用，后续实验将进一步探讨血管化和血供在bBMP 异位成骨中的作用。

bBMP 无需任何载体即可在肌肉中异位成骨，通过软骨化骨成骨，骨质在血供充分的外周未见明显降解吸收，提示 bBMP 异位成骨存在潜在的应用价值。

[1]Urist MR.Bone formation by autoinduction.Science, 1965, 150(698):893-899.

[2]Urist MR, Lietze A, Mizatani H, et al.A bovine low molecular weight bone morphogenetic protein (BMP) fraction.Clin Orthop Relat Res,1982, (162):219-232.

[3]Yu LM, Wang ZL.Advances of bone morphogenetic protein 2 induced ectopic bone formation in skeletal muscle.J Oral Maxillofac Surg,2008, 18(4):300-303.(in Chinese)於丽明, 王佐林.BMP2诱导骨骼肌成骨的研究进展.口腔颌面外科杂志, 2008, 18(4):300-303.

[4]Yoshida K, Bessho K, Fujimura K, et al.Osteoinduction capability of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in intramuscular and subcutaneous sites: an experimental study.J Craniomaxillofac Surg, 1998, 26(2):112-115.

[5]Kanczler JM, Ginty PJ, Barry JJ, et al.The effect of mesenchymal populations and vascular endothelial growth factor delivered from biodegradable polymer scaffolds on bone formation.Biomaterials,2008, 29(12):1892-1900.

[6]Kusumoto K, Bessho K, Fujimura K, et al.Prefabricated muscle flap including bone induced by recombinant human bone morphogenetic protein-2: an experimental study of ectopic osteoinduction in a rat latissimus dorsi muscle flap.Br J Plast Surg, 1998, 51(4):275-280.

[7]Inoda H, Yanmmoto G, Hattori T.rh-BMP2-induced ectopic bone for grafting critical size defects: a preliminary histological evaluation in rat calvariae.Int J Oral Maxillofac Surg, 2007, 36(1):39-44.

[8]Cooley BC, Daley RA, Toth JM.Long-term BMP-2-induced bone formation in rat island and free flaps.Microsurgery, 2005, 25(2):167-173.

[9]Jingushi S, Urabe K, Okazaki K, et al.Intramuscular bone induction by human recombinant bone morphogenetic protein-2 with beta-tricalcium phosphate as a carrier: in vivo bone banking for muscle-pedicle autograft.J Orthop Sci, 2002, 7(4):490-494.