散血明目片对兔视网膜静脉阻塞后视网膜组织中诱导型一氧化氮合酶表达的影响

彭清华 张波涛 叶群如 曾志成 韩 琦 姚小磊

2湖南省桂阳县人民医院眼科

3辽宁省沈阳市第一人民医院眼科

视网膜静脉阻塞（Retinal vein occlusion，RVO）是临床上较常见的、容易导致视力丧失的眼底疾病之一，也是仅次于糖尿病视网膜病变的致盲性视网膜血管病〔1〕。视网膜静脉阻塞的发病原因存在多种，具体的发病机制尚不完全明了。现代研究显示视网膜静脉阻塞后视网膜局部组织的血流灌注减少，继而血管内皮细胞缺氧可使诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达增加〔2〕。 散血明目片有活血通脉利水明目之功效，已往研究证实其对玻璃体积血等眼底出血患者有较好的临床疗效〔3〕。本实验用活血通脉利水明目之散血明目片混悬液对兔RVO模型进行灌胃，观察其对兔视网膜静脉阻塞后iNOS表达的干预作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：健康有色家兔18只，雌雄各半，4～6月龄，体重2.0～2.5 kg（湖南中医药大学动物实验中心提供，许可证号：湘医动字第20-003号）。

1.1.2 药物：散血明目片：由三七、酒大黄、蒲黄、猪苓、防己、地龙、白茅根等活血通脉利水明目中药按现代制剂制备工艺制成，0.3 g/片，选用同一批号药物（批号020624）。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时研成粉末，温开水混合成100 ml含散血明目片12 g的混悬液。

1.1.3 仪器与试剂：莱特眼底激光治疗仪（法国光太公司）；CF-60UD眼底荧光造影（FFA）仪（日本佳能公司）；裂隙灯显微镜，直接检眼镜，角膜接触镜等。一氧化氮试剂盒（酶法）、iNOS多克隆抗体、液体DAB酶底物显色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备：将实验动物随机分为3组，每组6只。分别为：正常对照组、模型组、散血明目片组。将模型组、散血明目片组实验兔术前12小时禁食禁水，造模前每只家兔交替点1%阿托品滴眼液和托品卡胺滴眼液充分扩瞳，先做正常眼底彩色照相及眼底荧光血管造影。随机摘除正常对照组1只家兔的双眼，置于固定液中，固定至少48小时以上，作为正常对照。视网膜静脉阻塞（RVO）模型参照周正申等〔4〕介绍的采用激光光凝视网膜中央静脉造模法制造。1%的卡因滴眼液双眼角膜表面麻醉后，通过三面镜应用氩蓝-绿激光（488 nm，514 nm）直接光凝视网膜静脉上、下主干。初次光凝能量选择280～340 mW，光凝点数依具体情况而定，曝光时间0.1秒，光斑直径100 μm。激光光凝封闭静脉时准确聚焦于静脉，避免损伤邻近的动脉。光凝封闭的静脉段长度约1DD，直至被封闭的静脉段变细发白，血流停滞，其远端迂曲扩张。光凝时由远端向近端照射，以免光凝处静脉内压力过高而破裂，影响操作。激光光凝封闭视网膜静脉后，即作眼底彩色照相及眼底荧光血管造影（FFA），观察血管闭塞情况，若闭塞不完全则补充光凝封闭。一般情况下补充光凝1次就足够，过度光凝视网膜静脉上下主干，往往由于过于强烈的组织反应使视网膜坏死。24小时后再复查FFA，证实视网膜静脉上、下主干完全阻塞。

1.2.2 给药方法：正常对照组、模型组每日以0.9%生理盐水灌胃；散血明目片组每日以散血明目片混悬液按0.25 g/kg灌胃（成人临床剂量为0.17 g/Kg），各组给药体积均为2 ml/kg。连续用药3周，1次/天。

1.2.3 取材及标本的制备：造模后14天用空气栓塞法将动物处死，迅速摘取标本浸入装有4%多聚甲醛的广口瓶中，固定24小时后脱水，于角膜缘后0.5 mm处剪开眼球壁，去除眼前节和玻璃体，余下的眼杯，用石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，做免疫组化备用。

1.2.4 指标测定：对iNOS进行免疫组织化学染色、DAB显色、苏木素复染胞核、分化返蓝、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察相关抗原的表达变化，以细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达信号。其中以已知的阳性片为阳性对照；以PBS取代一抗作为阴性对照，阴性对照不着色。iNOS表达的结果以平均光密度值和平均灰度值表示，平均光密度越大，表示相关的抗原表达越强；平均灰度值越小，表示相关的抗原表达越强。

1.3 统计学分析

应用SPSS14.0统计学软件进行分析，实验结果所有数据均采用均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较方差齐者用单因素方差分析，组间两两比较用q检验，方差不齐者用Dunnett’T3检验。

2 结果

2.1 HE染色病理观察

正常对照组切片为正常视网膜组织；模型组：可见视网膜组织内层神经纤维层已受到严重损害，内核层与外核层均变薄；散血明目片组：与模型组相应时相点比较，视网膜组织内层神经纤维层，内核层及外核层厚度均增加，仅有少量空泡（图1）。

2.2 iNOS免疫组化活性表达计算机图像分析结果

经平均光密度值和平均灰度值的组间相互比较，3组 iNOS的表达差异均有统计学意义（P＜0.01）。模型组iNOS表达显著高于正常对照组与散血明目片组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。散血明目片组iNOS表达虽显著高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），但较模型组低（表1）。

表1 三组视网膜组织iNOS表达的比较 （±s）

表1 三组视网膜组织iNOS表达的比较 （±s）

注：①模型组与正常对照组比较，P＜0.01；②散血明目片组与模型组比较，P＜0.01。

3 讨论

视网膜静脉阻塞属中医“暴盲”、“络损暴盲”范畴，因眼部血液运行受阻，溢于脉外，导致眼底出血、视力下降，其眼血液动力障碍、血液流变性异常、血小板聚集及全身微循环障碍等与典型的中医血瘀证的特点相一致。但仅对瘀血治疗是不够的，RVO患者在临床上除有出血表现外，由于血管阻塞，脉中津液也一起外渗，往往伴有视网膜的水肿，渗出，不少患者还伴有黄斑囊样水肿，其病变过程中始终存在着水血夹杂的病机，在病变的中后期又表现为水血互结。正如唐容川在《血证论》所述：“血病而不离乎水”；“血积既久，其水乃成”；“水病而累及血，瘀血化水”。由于水与血在生理上同源，病理上互累，因而必须水血同治。通过总结前人经验并结合自己的临床实践，我们认为在本病的整个治疗过程中应采用活血利水之法，即不仅要活血通脉，而且要利水散结明目，组方使用散血明目片。

前期的临床研究表明〔5〕：活血药与利水药配合使用，可加快出血的吸收，从而促进病变的恢复。患者经活血通脉利水明目法治疗后，其血液流变学指标明显改善。另外，散血明目片还能促进玻璃体积血的吸收，改善眼底的状况，改善全身的血液流变性，降低血液粘滞性和聚集性，降低血小板的活化功能，减轻血管内皮细胞的受损等，从而全面改善患者的血瘀状况，加速积血的清除，提高玻璃体积血患者的视功能〔6，7〕；能够明显降低兔视网膜静脉阻塞 RVO模型内皮素 1（endothelin 1，ET-1）表达，抑制其 1 型纤溶酶原激活物抑制物（type-1 plasminogen activator inhibitor，PAⅠ-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在视网膜上高表达，诱导组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator，tPA）的高表达，抑制血栓形成〔8-10〕。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是体内一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化 L-精氨酸释放的一种小分子内源性反应气体，在细胞内和细胞外发挥神经递质作用，能够舒张眼部微血管，调节眼部的血流量。研究发现，RVO发生后视网膜会很快出现局限性NO生成和释放减少，而使微小动脉收缩，NO失衡是RVO毛细血管无灌注区形成的主要原因〔11〕。

现已证明，在生理状态下血管系统内的NO主要由内皮细胞中的组成型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）催化合成，但其活性维持时间较短；在病理状态或在内毒素及某些细胞因子刺激下，NOS的另一种异构体诱导型NOS（iNOS）将被激活〔12〕，其产生的NO，适量可补偿内源性NO不足，过量可引起细胞和组织损伤，且持续时间较长。NO化学性质非常活泼，在体内半衰期仅有5s，较难测定，故组织中NO的水平主要取决于其中NOS的活性。NOS是NO生物合成的关键酶（限速酶），通过检测NOS可以反映NO水平。

本实验结果显示，三组的平均光密度值和平均灰度值的组间相互比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。模型组iNOS表达显著高于正常对照组（P＜0.01），表明造模成功；散血明目片组iNOS表达低于模型组（P＜0.01），因而推测散血明目片可以减弱兔RVO模型视网膜由于缺氧而诱导的iNOS表达，减轻NO过量生成对视网膜细胞造成的毒性伤害作用。

1 刘家琦.实用眼科学[M].2版.北京：人民卫生出版社，1999.467.

2 Fagan KA，Tyler RC，Sato K，et al.Relative contribution of endothelial，inducible and neuronal NOS to tone in the murine pulmonary circulation[J].Am J Physiol，1999，277（3）：472-478.

3 彭清华，李建超，张 琳，等.散血明目片治疗玻璃体积血的临床及实验研究[J].中国医药学报，2004，19（增刊）：61-64.

4 周正申，王 玲，王康孙.视网膜静脉阻塞的动物模型[J].中国实用眼科杂志，2003，21（6）：447-451.

5 彭清华.活血利水法为主治疗视网膜静脉阻塞的临床研究[J].中国中医眼科杂志，1994，4（4）：206-209.

6 张 琳，彭清华，李建超.散血明目片治疗玻璃体积血的实验研究[J].中国中医眼科杂志，2002，12（2）： 63-66.

7 李建超，彭清华，赵海滨，等.散血明目片抑制积血所致PVR的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，2002，8（11）：36-39.

8 彭清华，彭 俊，张波涛，等．复方中药散血明目片对兔视网膜静脉阻塞 ET-1 表达的影响[J].国际眼科杂志，2009，9（11）：2075-2077.

9 彭 俊，彭清华，曾志成．中药散血明目片抑制兔视网膜静脉阻塞后视网膜 VEGF 和 bFGF 的表达[J].国际眼科杂志，2010，10（1）：55-57.

10彭清华，彭 俊，曾志成，等.散血明目片对兔视网膜静脉阻塞模型 tPA、PAⅠ-1 表达的影响[J].中华中医药杂志，2010，25（8）：1299-1302.

11 Zimmermann M，Seifert V.Endothelin and subarachnoid hemor-rhag：an overview[J].Neurosurgery，1998，43（4）：863-876.

12 Knowles R G，Moncada S.Nitric oxide synthases in mam-mals[J].Biochem J，1994，298（2）： 249-258.