酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力*

李丹，赵新淮

(东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨，150030)

酪蛋白的谷氨酰胺酶水解及其产物的金属离子螯合能力*

李丹，赵新淮

(东北农业大学，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨，150030)

利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)对酪蛋白进行限制性脱酰胺和水解处理，以SDS-PAGE及排阻色谱分析评价产物的蛋白质降解情况，并制备具有较低脱酰胺度的脱酰胺酪蛋白产物。在酪蛋白质量浓度为5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37℃的条件下分别反应6 h、12 h和24 h，制得脱酰胺度分别为2.8%、5.8%和8.5%，水解度分别为2.5%、3.4%和4.9%的脱酰胺酪蛋白。评价这3种脱酰胺酪蛋白产物对Fe2+和Ca2+的螯合能力，结果表明，脱酰胺酪蛋白产物对Fe2+和Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，并随着脱酰胺度的增加而提高。

谷氨酰胺酶，酪蛋白，脱酰胺，螯合能力，铁，钙

食品蛋白质经过特定的修饰会改变其相应性质，如酶法水解既能获得具有生物活性的肽［1］，又可提高食品蛋白质的功能性质［2］。酶处理方法的反应条件相对温和，一般不会导致有毒物质的产生。食品蛋白质经过脱酰胺作用后，能够改善一些功能性质，因此具有潜在的食品加工应用价值［3］。例如，燕麦分离蛋白经脱酰胺处理后溶解性、乳化性等功能性质均有显著增强［4］。对小麦蛋白进行脱酰胺作用，结果表明，中性pH条件下脱酰胺小麦蛋白的溶解性及乳化性质有显著的提高［5］。另外，蛋白质水解产物对一些矿物质元素(如Fe2+和Ca2+)有较好的螯合作用，可以作为配体来提高矿物质的溶解性，提高矿物质的生物利用率［6］。Kumagai等［7］发现，去肌醇六磷酸大豆球蛋白经脱酰胺后对Ca2+的螯合能力，相比大豆球蛋白以及去肌醇六磷酸大豆球蛋白对Ca2+的螯合能力都有所增强。研究还发现，即使经消化酶作用后，去肌醇六磷酸脱酰胺大豆球蛋白仍具有较高的Ca2+螯合能力，并且脱酰胺大豆球蛋白及其水解产物显著提高小肠对Ca2+的吸收利用率［8］。

本研究利用谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)对酪蛋白进行限制性脱酰胺，得到较低脱酰胺度或水解度的脱酰胺产物，并对其Fe2+和Ca2+螯合能力进行评价和比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白(蛋白质含量93.8%)、3-(2-吡啶基)-5，6-双(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(ferrozine)、谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)，均购自Sigma公司;标准蛋白Marker，购自索莱宝科技有限公司;其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

UV-2401PC紫外-可见分光光度计，日本岛津公司;Kjeltec TM 3200全自动凯式定氮仪，瑞士Foss公司;UVP/C8484－05G凝胶成像分析系统，美国UVP公司;AKTA100蛋白纯化仪，美国GE Amersham公司;AA－800原子吸收分光光度计，美国Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的限制性酶解

配制质量浓度为10%酪蛋白溶液，并用0.2mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0。配制0.01 g/mL谷氨酰胺酶溶液(现用现配)，将一定量的酪蛋白溶液与超纯水、不同体积的谷氨酰胺酶溶液混合，配制成酪蛋白质量浓度为5%、酶添加量分别为100、400、700 U/kg酪蛋白的反应体系。反应体系在37℃下酶解6～36 h，按照以下方法分别测定产物的脱酰胺度及水解度。以未加谷氨酰胺酶溶液的酪蛋白溶液为空白。

1.3.2 相关分析

1.3.2.1 蛋白质含量、脱酰胺度以及水解度的测定

(1)蛋白质含量:凯氏定氮法［9］。

(2)脱酰胺度测定:苯酚-次氯酸盐法［10］。

反应结束后，取反应液2mL置于离心管中，并立即加入2mL质量分数为12%的三氯乙酸终止反应，12 000 r/min离心10 min除去沉淀，上清液待测。

试剂A:分取5.0 g苯酚、25 mg亚硝基铁氰化钠，溶于双蒸水中，定容至500mL。

试剂B:取2.5 g NaOH溶于双蒸水中，加入4.2mL的质量浓度为6.5%的次氯酸钠溶液，定容至500mL。试剂A和试剂B均置于棕色试剂瓶中，4℃冰箱中储存备用。

移取5.0mL试剂A于试管中，加入20μL样品溶液(或20μL双蒸水)，充分振荡、混匀。移取5.0mL试剂B加入到上述混合溶液中，充分振荡、混匀。37℃水浴中反应20 min，冷却至室温，并在625 nm波长测定溶液吸光值a(或b)。以硫酸铵标准溶液(0.2～1μg/μL)绘制标准曲线;根据所得差值(ab)和标准曲线，计算样品中游离氨浓度。

称取一定量的酪蛋白，置入水解管，然后加入5mL终浓度为3mol/L的H2SO4，用酒精喷灯密封水解管，110℃下水解24 h。水解完毕后，将水解液中和至中性并稀释一定倍数后，按上述方法，在625 nm波长测定水解液稀释液的吸光值。根据标准曲线，计算出酪蛋白中谷氨酰胺和天冬酰胺残基总量。脱酰胺度计算公式如式(1):

(3)蛋白质水解度的测定:邻苯二甲醛(OPA)法［11］。

OPA试剂:取2.00 g十二烷基磺酸钠(SDS)，加入一定量硼酸缓冲溶液(pH 9.5)，待完全溶解后，加入 1mL 80mg/mL 的 OPA 乙醇溶液、200μL β-巯基乙醇，最后用硼酸缓冲溶液定容至100mL。此溶液现用现配。

将样品溶液稀释至一定倍数后，取3mL样品稀释液与同体积OPA试剂混合并开始计时，准确反应5 min，立即在分光光度计上340 nm波长处测吸光值。以亮氨酸标准溶液(12～36μg/mL)绘制标准曲线，利用标准曲线计算样品中游离氨基浓度(μmol/mL)。水解度计算公式如式(2):

1.3.2.2 SDS-PAGE分析

采用不连续垂直板状凝胶电泳，浓缩胶浓度为4%、分离胶浓度为15%。浓缩胶和分离胶配此组成见表1［12］。凝胶板面积120 mm×100 mm，凝胶厚度1.5 mm，上样量10μL。电泳时初始电压80V，待样品进入分离胶时电压增至120V;当溴酚蓝指示剂迁移到凝胶板底部时，停止电泳。剥离凝胶，加入戊二醛固定液固定1 h。取出固定好的凝胶在染色液(含0.25%考马斯亮蓝R250、45%甲醇、10%乙酸)中染色3～5 h，弃去染色液，加入脱色液［V(甲醇)∶V(冰乙酸)∶V(水)=2∶2∶9］，经常更换脱色液，直至凝胶的蓝色背景褪去，蛋白质色带清晰为止。然后于凝胶成像系统中对各条带进行分析。

表1 SDS-PAGE电泳分析时凝胶的配制

1.3.2.3 排阻色谱分析

采用Chu等人［13］的方法，略有改动。将酪蛋白以及脱酰胺酪蛋白产物溶于0.2mol/L、pH值12的磷酸盐缓冲溶液中，终浓度为2mg/mL;洗脱剂为0.2mol/L、pH值12的磷酸盐缓冲溶液。样品溶液和洗脱剂通过0.45 μm微孔滤膜过滤，并用超声波脱气。利用美国GE Amersham公司AKTA蛋白纯化仪进行测定。柱子型号为10 mm×300 mm、填料为Pharmacia Superdex－75凝胶。上样量为0.5mL，压力1.80 MPa，洗脱速度0.5mL/min。蛋白质检测波长280 nm。每次进样前用洗脱流动相冲洗进样环。

1.3.2.4 Fe2+螯合能力测定

采用 Xu等人［14］的方法，稍有改动。准确吸取250μL 1mg/mL的样品溶液(样品最终浓度为100μg/mL)直接与 XμL 1 mmol/L的 FeCl2溶液混合(最终浓度为10～60 μmol/L，此溶液现用现配)，加入一定量的超纯水使反应体系终体积为1.5mL。混匀后放置2 min，再加入1mL 500 μmol/L的Ferrozine水溶液(终浓度为200 μmol/L)，充分振荡、混匀。混合体系在室温下静置10 min，使充分反应形成Fe2+-Ferrozine复合物，用紫外分光光度法在562 nm条件下测吸光值。对照样中加入一定量的EDTA溶液(终浓度为10 μmol/L)。整个过程中，使用的水为超纯水。样品对Fe2+的螯合效率计算见公式(3):

式中:AT，样品吸光度;AC，对照样吸光度［XμL 1 mmol/L的FeCl2溶液加入(2 500－X)μL超纯水］。

1.3.2.5 Ca2+螯合能力的测定

采用Bao等人［15］的方法，略有改动。

(1)将0.03 g样品溶解于3mL、pH7.4的 Tris-HCl缓冲溶液，37℃水浴中放置10 min，充分溶解后加入0.04mol/L的CaCl2溶液1mL。37℃水浴中反应30 min后，6 000 r/min离心5 min，收集上清液。将上清液稀释至一定倍数，用原子吸收光谱法测定上清液中的Ca2+含量A。Ca2+螯合能力计算公式为:

式中:AT，总Ca2+的量(mol);A，上清液中 Ca2+的量(mol);P，蛋白质质量(g)。

(2)钙含量测定:采用空气-乙炔火焰原子吸收光谱法(FAAS法)。用质量分数为3%的硝酸溶液将Ca2+标准储备液(国家标准物质研究中心)逐级稀释成0、2、4、6、8、10μg/mL 系列标准溶液。测定条件为:波长422.7 nm，灯电流8 mA，狭缝0.7 nm，乙炔流量1 L/min，空气流量4.0 L/min，燃烧器高度10 mm。测定标准系列溶液(浓度由低到高)的Ca2+含量，仪器自动处理数据，并显示标准曲线。确认后，按顺序进行空白和样品溶液的测定。计算机给出测定结果［10］。

1.3.3 统计分析

采用SPSS 13.0软件对结果进行统计、分析，采用Excel 2003软件绘制图示。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白的脱酰胺反应条件及水解度

研究发现，谷氨酰胺酶对酪蛋白的脱酰胺作用随酶添加量的增加而增加(如图1所示)。在37℃条件下，初始反应阶段(0～18 h)，酪蛋白的脱酰胺度随反应时间的延长而显著增加;反应24 h以后，酪蛋白的脱酰胺度几乎没有显著增加。因此，反应24 h足可以完成酪蛋白的脱酰胺反应。对比酶添加量的影响，发现脱酰胺度随着酶添加量的增加而大幅度增加。酶添加量为100 U/kg酪蛋白或者400 U/kg酪蛋白时，酪蛋白的脱酰胺度比酶添加量为700 U/kg酪蛋白的脱酰胺度低。反应24 h时，酶添加量分别为100、400、700 U/kg酪蛋白时，酪蛋白的脱酰胺度分别为3.9、8.5、10.2%。考虑到反应效率、酶成本等因素，在以后研究中酶添加量选用400 U/kg酪蛋白。

图1 反应时间和酶添加量对酪蛋白脱酰胺的影响(n=3)

酪蛋白的脱酰胺度还与反应温度有关(如图2)，可以看出，随着反应时间的延长，酶添加量为400 U/kg酪蛋白时，32、37和42℃进行的脱酰胺反应，只有37℃下脱酰胺度最高，说明谷氨酰胺酶在37℃下的脱酰胺活力最高。因此，可以初步确定，酪蛋白脱酰胺反应的适宜反应条件为质量浓度为5%的酪蛋白溶液、反应温度37℃、酶添加量400 U/kg酪蛋白。此条件下，当反应分别进行6、12、24 h时，酪蛋白的脱酰胺度分别为2.8%、5.8%、8.5%，相应的水解度分别为2.5%、2.4%、4.9%，这些产物是具有较低脱酰胺度的水解酪蛋白，在以后的研究中分别称为脱酰胺酪蛋白 1、2、3。

图2 温度对酪蛋白脱酰胺反应的影响(n=3)

2.2 SDS-PAGE及排阻色谱分析

通过SDS-PAGE发现，与酪蛋白相比，3种脱酰胺酪蛋白在分子质量为31.0 ku附近的肽段几乎完全被水解(如图3所示)，即谷氨酰胺酶使酪蛋白几乎完全水解成小肽。小分子质量的肽主要分布在20.1、14.4 ku附近以及14.4 ku以下，并且随着脱酰胺反应时间的延长，小分子质量的肽段更多。这再次说明谷氨酰胺酶对酪蛋白除了具有脱酰胺作用外，还有一定的水解作用。

图3 酪蛋白与脱酰胺酪蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

酪蛋白与2个脱酰胺酪蛋白的排阻色谱分析结果如图4所示。从分析结果上看，2个脱酰胺蛋白的峰形与酪蛋白的峰形差异显著，说明酪蛋白在脱酰胺过程中几乎被完全水解并生成分子质量更小(洗脱时间更长)的产物。这一结果也证明了SDS-PAGE分析结果，即谷氨酰胺酶对酪蛋白具有水解作用。

图4 酪蛋白与脱酰胺酪蛋白排阻色谱分析结果

2.3 酪蛋白及其脱酰胺酪蛋白对Fe2+、Ca2+的螯合能力

以EDTA为对照样，向EDTA、酪蛋白以及脱酰胺酪蛋白溶液中加入10～60 μmol/L的Fe2+，考察它们对Fe2+的螯合能力，结果如图5A所示。脱酰胺酪蛋白对Fe2+螯合的能力比酪蛋白、10 μmol/L的EDTA的更强(尤其是在较高Fe2+添加量)，整体上约增加50%～400%，并且脱酰胺酪蛋白螯合Fe2+的能力大小依次为脱酰胺酪蛋白3、脱酰胺酪蛋白2、脱酰胺酪蛋白1。图5B为酪蛋白以及脱酰胺酪蛋白对Ca2+的螯合能力测定结果。脱酰胺酪蛋白1、脱酰胺酪蛋白2以及脱酰胺酪蛋白3的Ca2+螯合能力分别为 1.23、1.41、1.49 mmol/g，而酪蛋白为 1.05 mmol/g，即脱酰胺酪蛋白对Ca2+的螯合能力也是随着脱酰胺度的增加而增强，并且都高于酪蛋白。这些结果表明，脱酰胺过程中酪蛋白的谷氨酰胺残基转换成谷氨酸残基，因此，更多的Fe2+或Ca2+结合于脱酰胺酪蛋白。理论上，酪蛋白中谷氨酰胺残基转换成谷氨酸残基的数量越多(即脱酰胺度越高)，螯合Fe2+或Ca2+的能力就越强。

图5 酪蛋白与脱酰胺酪蛋白对Fe2+和Ca2+的螯合能力

食品蛋白质具有螯合金属离子的能力，蛋白质对Ca2+和Fe2+的螯合能力越强，越能够提高元素的生物利用率，有利于机体对矿物质元素的吸收利用率。此外，Fe2+和Cu2+能够催化反应形成氧自由基，对Fe2+和Cu2+的螯合能力越强，则蛋白质的抗氧化能力就越强。综上所述，脱酰胺酪蛋白可以作为一种很好的蛋白质基料，并在食品加工中具有一定的潜在应用价值。

3 结论

谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)对酪蛋白具有脱酰胺和肽键水解作用能力。在酪蛋白质量浓度为5%、谷氨酰胺酶添加量400 U/kg酪蛋白、37℃的最佳反应条件下，分别反应6、12、24h制得3种脱酰胺酪蛋白，其脱酰胺度分别为2.8%、5.8%、8.5%，水解度分别为2.5%、3.4%、4.9%。SDS-PAGE以及排阻色谱分析结果证明，谷氨酰胺酶对酪蛋白具有水解作用。分析结果表明，脱酰胺酪蛋白对Fe2+及Ca2+的螯合能力均高于酪蛋白，且螯合能力与脱酰胺度相关。

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Hydrolysis of Casein by Glutaminase and Metal Chelating Activity of the Prepared Products

Li Dan，Zhao Xin-huai
(Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

Glutaminase(EC 3.5.1.2)was applied in the present work to treat casein for deamidation and hydrolysis to a limited reaction extent.SDS-PAGE and size exclusion chromatography analysis were used to evaluate the degradation of casein.Some deamidated casein products with lower degree of deamidation were prepared with reaction conditions of casein concentration of 5%(w/v)，glutaminase addition level of 400 U/kg casein，reaction temperature of 37℃ and reaction time were 6，12 and 24 h，respectively.Three deamidated casein products prepared had the degree of deamidation of 2.8%，5.8%and 8.5%，or degree of hydrolysis of 2.5%，3.4%and 4.9%，respectively，were prepared.The iron or calcium(II)chelating activities of three deamidated caseind products were analyzed.The results indicated that the iron or calcium(II)chelating activities of three deamidated casein products were higher than that of casein，and would be enhanced as degree of deamidation increased.

glutaminase，casein，deamidation，chelating activity，iron，calcium

博士研究生(赵新淮教授为通讯作者)。

*黑龙江省高等学校科技创新团队建设计划项目(2010td11)和东北农业大学创新团队发展计划资助项目(CXT007－1－1)。

2010－06－18，改回日期:2010－07－25