采用微量热法快速检测食品中的细菌总数*

农卫良，管骁，徐斐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海，200093)

采用微量热法快速检测食品中的细菌总数*

农卫良，管骁，徐斐

(上海理工大学医疗器械与食品学院，上海，200093)

以酱牛肉中的污染菌为测试菌，利用微量热仪测定了细菌的生长热谱曲线。结果表明，选择24 h的菌体活化时间，并在优化培养基中培养4 h后计算菌体生长热效应值，在103～106CFU/mL范围内菌体放热量能较好地反映细菌总数值，且微量热法测得结果与常规平板计数法无显著差异。

微量热法，细菌总数，快速检测

对食品中的细菌总数进行快速测定是现代食品卫生控制工作中的一项重要任务［1］。近年来，随着诸如酶联免疫吸附分析、聚合酶链反应技术、微量热法等新技术的开发成功［2－3］，为细菌总数的快速定量提供了多种可能。这些快检技术原理各不相同，适用范围也存在差异。其中微量热法具有通用性强，适用于所有微生物检测等特点，备受食品工作者的关注［4］。微量热法快速检测微生物是利用微生物生长时产生热效应的原理设计而成的，微生物在生长和代谢的过程中，能产生一定的代谢热，且热效应与微生物的数量呈比例关系。然而目前此法的发展也受到一些因素的限制，如微生物生长热效应过程周期长、热信号小等，因而对热量值进行定量往往误差较大。若能有效放大微生物的热信号值，将对采用微量热法对微生物进行快速定量具有重要意义。前期试验已对量热用细菌培养基进行了优化研究，本试验通过测定微生物生长热来表征初始细菌总数，并将微量热法测定结果与常规平板计数法进行比较，以期验证微量热法在细菌快速定量中的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

菌种:来自于酱牛肉中的优势菌株，本实验室自行分离纯化;细菌混悬液是按照酱牛肉样品中各种细菌的平均比例进行混悬。

NaCl、葡萄糖、MaSO4均为分析纯试剂，胰蛋白胨、牛肉浸膏等均为生化试剂。

1.1.2 仪器与设备

Micro DSCⅢ型微量热仪，法国SETARAM公司，蠕动泵BT00－300M:常州市城合卫生设备厂。

1.1.3 培养基的制备

普通培养基:胰蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉浸膏3 g溶于1 000mL蒸馏水中，调pH值至6.8～7.2，121℃高压灭菌20 min备用。

优化培养基:胰蛋白胨8.45 g、NaCl 5 g、MgSO40.2 g、酵母浸膏4.5 g、葡萄糖1.42 g溶于1 000mL蒸馏水，调pH值至7.2，121℃高压灭菌20 min备用。

1.2 实验方法

1.2.1 量热测定［5－6］

量热实验在微量热仪Micro DSC III上进行，采用停流法。首先对循环池及管路进行清洗消毒，清洗过程为:先以30mL/h流速的无菌蒸馏水清洗30 min，再用75%乙醇以相同流速清洗30 min，最后用无菌蒸馏水再冲洗30 min。待基线平稳后，以30mL/h的流速泵入接过菌种的细菌培养液，确认培养液已充满流动池后停泵，仪器即开始测量记录循环池内细菌生长代谢的热功率－时间曲线。测量过程完成后，对该生长热曲线进行积分计算出细菌生长代谢过程的累积放热量 Q［4，7］。

1.2.2 细菌活化时间对放热的影响

冷藏菌种的活化在普通培养基倒成的平板上进行。在其他培养条件相同的条件下，改变量热实验前细菌的活化时间(分别为12、24、36和48 h)，然后在接种相等菌量的条件下进行量热实验，比较细菌前期活化时间对其生长放热量的影响。

1.2.3 初始细菌总数和放热量Q的关系

其他条件相同情况下，考察不同初始细菌接种量分别在优化培养基中培养不同时间(4、5、6、7 h)(即对应热谱曲线中不同的积分时间)和累积放热量之间的对应关系。

1.2.4 标准曲线的建立

利用上述优化实验得到的最佳测热条件，对不同细菌总数的菌悬液(1 000～100 0000 CFU/mL)进行热量值测定，建立“热量值－细菌总数”的标准曲线。

1.2.5 确证实验

制取未知菌液浓度的菌悬液，分成2份，1份利用量热法检测未知浓度菌悬液4 h的放热量，并通过细菌放热标准曲线计算得到细菌总数。另1份用平板计数法检测细菌总数。对2种方法的结果进行比对，验证标准曲线的准确性。

2 结果与分析

2.1 培养基成分对细菌放热的影响

量热过程中所使用培养基的不同会直接影响到细菌的生长状况，进而对细菌的生长热效应产生影响。通过量热实验分别得到细菌在优化培养基和普通培养基中的生长热谱图，如图1所示。

图1 细菌在不同培养基中的生长放热图谱

从图1可以看出，细菌在普通培养基中生长，虽有热效应峰出现，但峰形不够明显且不规则，而细菌在优化培养基中生长出现了典型的特征性放热峰，且比较好地反映出了细菌生长的4个时期，这可能是由于菌体在不同培养基中生长状况不同而造成生长热效应有差异引起的［4，8－9］。通过对热谱曲线不同时间段的积分，可以求得细菌生长不同时期所产生的累积热效应，结果如图2所示。从图2可以看出，在普通培养基中生长的细菌生长热效应不如在优化培养基中的显著，且累积热效应与放热时间的关系呈先增加(5 h之前)后减小的变化趋势，这可能是由于细菌在生长初期正常生长放热，到后期出现菌体自溶吸热所造成的［10］。相比之下，菌体在优化培养基中的生长热效应较大，且在7 h的测热过程中持续放热，热效应与放热时间呈现出较好的线性关系，由此说明优化培养基更有利于在微量热法测定过程中的应用。

图2 细菌在不同培养基中生长热效应的比较

2.2 细菌前期活化时间对其生长放热的影响

细菌活化过程即细菌恢复性培养，该过程可使细菌恢复至良好的生长状态，这对后面的量热实验成败至关重要。低温长时间保藏的菌种生理上处于休眠期，因此在量热实验前需对其进行活化，从而将细菌开始放热时间提前，并增大累积热信号值。活化时间的长短与活化效果紧密相关。不同活化时间对量热实验的影响如图3所示。从图3可见，细菌活化24 h后放热状态达到最佳，出现特征性双峰，重现性高。而活化12 h细菌在平板中的生长情况不佳，活性不足，未能出现预计的放热峰，但在4～5 h波动较大，说明在此区间已处于对数生长期，但放热不均匀，波动大;活化时间为36、48 h的细菌在制成的菌悬液中出现抱团现象，不易溶解。虽活化时间为36 h的细菌出现放热峰，但已处于生长末期，放热量少。活化36 h和48 h的细菌放热曲线无明显规律，未出现特征性双峰，且重现性低，可能是活化时间过长，导致大部分细菌衰退死亡和分解代谢出一些不利于细菌生长的物质，影响细菌生长放热［11－13］。

2.3 初始细菌总数与放热量的关系

要将微量热法成功应用于食品中细菌的快速定量检测，应能保证使菌体在较短的时间内产生较大的热响应值。实验中比较了不同数量的细菌生长不同时间后所产生的热效应，结果如图4、图5所示。从图4中可看出，随着测热时间的延长，菌体累积热效应越大，生长5 h的放热量明显高于4 h，这可能是由于5 h前菌体处于对数生长期，生长活动旺盛;5 h后放热量增幅越来越小，说明菌体可能处于稳定期和衰亡期，这一点从热谱图(图3.b)中也可以看出来。由图5可知，对不同初始菌量的菌体而言，测定其4 h或5 h的累积热效应值与细菌总数间呈现了较好的线性关系，特别是4 h的放热量与细菌总数之间的线性关系R2值可达0.966 1。这间接印证了该时期菌体生长稳定，热效应持续;而测量6 h或7 h的热量值，发现细菌总数和热效应间已无明显的变化规律，这可能是由于此时的热效应不仅包括菌体的生长热，还包括菌体自溶、菌体代谢产物对自身的抑制作用等其他影响因素。在每次试验结束后，取出菌液进行平板计数，得到细菌在循环池内4～7 h的生长情况，结果也证明细菌在4～7 h内菌数增长缓慢，甚至减少。其原因可能是循环池内培养基中氧气耗尽与菌体生长竞争抑制作用导致的。因此，选择测热时间为4 h能较好体现细菌总数与放热量的对应关系。

图3 不同活化时间的细菌生长热谱图

图4 测热时间与放热量的关系

图5 不同细菌总数与放热量的关系

2.4 放热标准曲线的建立

通过以上对测热条件的优化实验，选择细菌活化时间24小时，然后将菌体接种于优化培养基中导入微量热仪循环池，测定菌体4 h内的生长热效应，并将热量值与初始细菌总数一一对应，即得到细菌总数的计数标准曲线，如图6所示。处理结果表明:若对该曲线进行二次回归拟合，得到的二次回归曲线y=－7.8×10－7x2+0.001 3x+0.100 8(r2=0.942 4)的拟合关系并不好;若作一段式线性拟合y=0.000 9x+0.114 1(r2=0.936 1)，拟合关系也不佳;但对该曲线进行分段线性拟合，如图6所示，AB段的拟合曲线为y=0.003 6x+0.043 6(r2=0.969 6)，BC段的为y=0.000 8x+0.180 8(r2=0.986 6)，由此可见分段线性拟合后各段之间的线性关系良好，因此可根据其放热量并采用分段标准曲线处理方式来计算对应的细菌总数。

图6 初始菌数与放热量之间的标准曲线

2.5 确认实验

利用微量热法对2份未知浓度的菌悬液进行细菌总数检测，并与传统的平板计数法结果比对，结果如表1所示。由表1可知，2种测定方法所得结果之间的误差小于10%(分别为7.76%和9.78%)，F检验结果表明该差异不显著，由此说明该标准曲线具有实际应用价值。特别值得指出的是，该标准曲线提供了103～106CFU/mL范围内的初始菌量的热量值，可以满足大多数实际食品样品中细菌总数的检测要求。但若细菌总数更小，由于能检测到的热信号较小，并易受到周围环境和仪器精度等因素的影响，应该考虑通过其他方式将其热信号进一步放大才能满足检测的要求，这有待于进一步的研究。

表1 标准曲线验证结果

3 结论

本试验在已筛选得到酱牛肉优势菌的基础上，对牛肉中的细菌总数微量热法快速测定实验条件进行了优化，优化后的实验条件可用于细菌总数的实测，并与传统的平板计数法结果进行比较。结果表明，细菌活化时间、测热培养基的选择及测热时间长短均对量热法测定结果影响显著，选择24 h的菌体活化时间，并在优化培养基中培养4h后计算菌体生长热效应值，在103～106CFU/mL范围内能较好地反映细菌总数值;且微量热法所得结果与常规平板计数法基本相符;重要的是，微量热法能大大减少检测时间，由常规的48 h减少为4 h。

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Study on Rapid Detection Method of the Microbial Biomass in Food by Microcalorimetry

Nong Wei-liang，Guan Xiao，Xu Fei
(School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093，China)

In this paper，the thermogram with respect to the growth of bacteria in beef was determined with microcalorimeter.The results indicated that the total amount of bacteria could be calculated by thermal effect of bacteria growth in the range of 103～106CFU/mL under the condition of active time 24 h and incubation for 4 h in optical culture.And there was no significant difference between the results obtained by the method of microcalorimetry and platecount.

microcalorimetry，microbial biomass，rapid detection

硕士研究生(徐斐教授为通讯作者)。

*上海市教委科研创新项目(08ZZ77)，上海市研究生创新基金项目(JWCXSL0902)，上海高校选拨培养优秀青年教师科研专项基金(slg－07047)

2010－01－25，改回日期:2010－08－23