五倍子单宁的超声提取工艺优化

江凯，李建科

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安，710062)

五倍子单宁的超声提取工艺优化

江凯1，李建科2

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安，710062)

通过正交实验法优化了五倍子单宁(Chinese Gallotannins，CGTs)的超声波提取条件，同时对五倍子单宁进行了纯化实验。结果表明:CGTs的最佳提取条件为，超声功率200 W，丙酮体积分数60%，液料比24∶1(mL∶g)，超声时间30min，提取温度40℃;最佳条件下，提取2次就可以达到CGTs的最大提取量92.27%。有机溶剂法纯化CGTs后纯度达到92.89%。

正交实验法，五倍子单宁，超声波提取，纯化

五倍子(Galla chinensis)为倍蚜科昆虫角倍蚜或蛋倍蚜在其寄主漆树科植物盐肤木(Rhus chinensis)、青麸杨(P.potaninii)或红麸杨(R.punjabensis)等树上形成的干燥虫瘿。五倍子产于亚洲东部和北美洲的美国、加拿大等国家。我国是五倍子主产国，产量约占世界总产量的95%，其中四川、贵州、湖南、湖北、陕西和云南6省的产量占全国总产量的80%左右，我国五倍子的现年产量约为5 000 t［1］。五倍子是中国的一种传统中药，外用消炎、止血、镇痛、去肿，治疗痔疮和脚气，内服治疗消化性溃疡、急慢性胃炎等［2］。五倍子的化学成分主要包括单宁、五倍子油、树脂、蛋白质、脂肪物质、淀粉、蜡质、矿物质等。其中，五倍子单宁(Chinese Gallotannins，CGTs)是五倍子的主要功能成分，并且是五倍子中含量最多的组分［3］。

文献检索发现，CGTs的研究涉及到提取纯化［4－6］、抗氧化［7］、抑菌［8］、组成成分分析［9－10］、结构鉴定［11］等领域。同时也有文献比较详细的讨论了CGTs在不同极性溶剂中表现出不同的抗菌和体外抗氧化活性［12］。由此可见，CGTs在生物活性方面的研究比较多，而且比较深入，对于CGTs提取方面的研究主要集中在不同提取溶剂的选择上［4－5］。本文采用正交法对超声波辅助提取CGTs的提取溶剂体积分数、液料比、超声时间、提取温度、超声功率等进行实验，同时还进行了CGTs纯化试验。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

五倍子，购于陕西汉中肚倍(potanin sumac nutgall)。

1.1.2 化学试剂

丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、氯化铵、氨水、EDTA、乙酸锌、铬黑T指示剂等均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。

1.1.3 要仪器设备

高速万能粉碎机(型号FW400A)，北京科伟永兴仪器有限公司;离心机(TDL－4型)，上海安亭科学仪器厂;电热恒温水浴锅:(HH－S4型)，北京科伟永兴仪器有限公司;台式恒温振荡器(THZ-D型);江苏太仓市实验设备厂;数控超声波清洗器(KQ-250DB型)，昆山市超声仪器有限公司;旋转蒸发仪(RE-52AA)，上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ型)，郑州长城科工贸有限公司;真空冷冻干燥机(ALPHA1-4型)，德国CHRTST公司。

1.2 实验方法

1.2.1 五倍子单宁的提取工艺

五倍子→干燥→粉碎→过筛→超声提取→过滤→离心→上清液→减压蒸馏回收溶剂→单宁粗品→纯化富集→真空冷冻干燥→单宁产品

1.2.2 操作要点

五倍子，破壳，去尸，于干燥箱中50℃鼓风干燥24 h，用FW400A万能粉碎机粉碎50 s，颗粒粒度为60～120目，将五倍子粉末置于棕色瓶中，干燥、避光保存。

称取2.5 g五倍子粉置于锥形瓶中，加入丙酮溶液，用保鲜膜封口，在膜上扎一些小孔，采用KQ－250DB型超声波清洗器进行超声辅助提取，真空抽滤，滤液经4 000 r/min离心15 min。

1.2.3 单宁含量测定方法

采用EDTA络合滴定法［13］测定单宁含量。

1.2.4 单因素实验

以丙酮为提取溶液、选用超声波辅助提取工艺中对提取率有影响的5个因素，即丙酮体积分数、液料比、超声时间、提取温度、超声功率、进行单因素实验，按照1.2.3方法提取五倍子单宁，并计算得率。

1.2.5 正交实验设计

根据单因素实验结果，选取最佳超声功率200 W，确定丙酮体积分数(A)、液料比(B)、超声时间(C)、和提取温度(D)作为考察因素，采用L9(34)正交实验考察4个因素对单宁得率的影响，对CGTs提取条件进行优化。正交实验因素水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.6 优化条件下五倍子单宁(CGTs)的超声波提取次数实验

在1.2.6中正交实验优化的提取参数条件下，对第一次五倍子提取的滤渣进行二次提取，研究CGTs得率与提取次数之间的关系。

1.2.7 五倍子单宁(CGTs)的纯化实验

取五倍子单宁粗提液，用一倍体积氯仿连续萃取3次，收集水相;然后加入二倍体积的乙酸乙酯，45℃摇床振荡30min，静置分层，收集乙酸乙酯相，再于40℃减压旋转蒸发回收乙酸乙酯后，真空冷冻干燥，得到五倍子单宁成品［5，14］，同时测定产品得率、单宁得率、单宁纯度。

产品得率/%=(产品质量/原料质量)×100单宁得率/%=(产品中单宁含量/原料质量)×100单宁纯度/%=(产品中单宁含量/产品质量)×100

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 丙酮体积分数对提取效果的影响

丙酮-水对单宁的溶解能力最强，能够打开植物内单宁-蛋白质的连接键，使单宁的提取率提高并且减压蒸发很容易将丙酮从浸提液中去掉，剩下单宁的水溶液［15］，因此本实验采用丙酮-水作为提取溶剂。由图1可知，当丙酮体积分数在30%～60%内时，CGTs得率随丙酮浓度的增加而增大，体积分数超过60%时得率反而下降。因此选定丙酮体积分数50%、60%、70%作为正交实验的3个水平。

图1 丙酮体积分数对CGTs得率的影响

2.1.2 液料比对提取效果的影响

由图2可知，液料比在24∶1以下时，CGTs得率随着液料比的增加而呈上升趋势，液料比超过24∶1后，CGTs得率反而下降。随着丙酮溶液的增加，CGTs的溶解量也增加，当丙酮溶液达到一定量时，CGTs溶解已经达到饱和，再增加丙酮溶液也不会使CGTs含量增加，但此时伴随着单宁溶出的杂质却增多，从而导致有效成分的相对含量减少。因此选定液料比16∶1、24∶1和32∶1作为正交实验的3个水平。

图2 液料比对CGTs得率的影响

2.1.3 超声时间对提取效果的影响

由图3可知，随着超声时间的延长，CGTs得率随之升高，但时间超过35 min后，变化缓慢且得率略有降低。从生产角度考虑，CGTs的提取时间以35 min左右为宜。因此选定超声时间30、35、40 min作为正交实验的3个水平。

2.1.4 提取温度对提取效果的影响

由图4可知，提取温度在30～45℃内时，CGTs得率随温度升高而增大，温度超过45℃时得率反而下降。温度的升高有助于CGTs的浸出，但单宁含有大量酚羟基，对温度较为敏感，热稳定性差［15］，当温度超过一定范围时，一方面CGTs溶解量可能会因溶解度降低而减少，另一方面单宁可能由于不稳定而发生其他不可逆的化学反应，从而最终导致得率的降低。因此选定提取温度40、45、50℃作为正交实验的3个水平。

图3 超声时间对CGTs得率的影响

图4 提取温度对CGTs得率的影响

2.1.5 超声功率对提取效果的影响

在超声提取实验中，超声功率是重要的选择参数，一般来说，超声波所产生的空化效应、粉碎、破壁等作用可以有效的增加提取率［16］。由图5可知，CGTs得率随着超声功率的增大而增大，在功率超过200 W时，CGTs得率增幅较小，趋于平缓。由于提取包括扩散、渗透、溶解等过程，提取功率愈大，提取愈完全，但当扩散达到平衡时，增大超声功率，提取率不再增大，所以超声功率采用200 W。

2.2 超声波提取CGTs的正交实验

正交实验结果见表2。由表2的方差分析可知，以上4个因素对CGTs得率的影响大小依次为B(液料比)＞A(丙酮体积分数)＞D(提取温度)＞C(超声时间)，液料比和丙酮体积分数对得率的影响较为显著。超声提取CGTs的最佳条件为A2B2C1D1，即丙酮体积分数60%、液料比24∶1、超声时间30min、提取温度40℃。

图5 超声功率对CGTs得率的影响

表2 实验设计与结果

2.3 正交实验验证结果

在优化工艺条件下，分别超声提取3份2.5 g五倍子，测得 CGTs得率分别为:708.3、707.9、709.7 mg/g。平均得率为708.6 mg/g。大于正交实验中所有实验组所测得率，故认为最佳工艺条件可行。

2.4 优化条件下五倍子单宁(CGTs)提取次数实验结果

由图6可知，经过反复提取，CGTs得率有所增加。第2次提取后得率达到719.6 mg/g，比第1次增加了11.6 mg/g，第3次为720.9 mg/g，较第2次增大幅度不明显，仅为1.3 mg/g。随着提取次数继续增加，CGTs得率逐渐趋于平稳而不再增加，表明CGTs已基本提出，因此，从生产成本考虑，CGTs的提取以2次为宜。

2.5 五倍子单宁(CGTs)纯化实验结果

量取200mL的CGTs粗提液，按照1.2.6方法进行富集纯化。实验测得，产品得率为244.7mg/g，单宁得率为227.3mg/g，CGTs纯度达到92.89%。溶剂萃取法是一种常见的分离纯化方法，由于水的极性大，五倍子中又含有水溶性的树脂、蛋白质、淀粉等，伴随着单宁溶出的杂质也较多，而乙酸乙酯能够溶解多种水解单宁及低聚的缩合单宁且对其他杂质无溶解能力，因此本实验采用乙酸乙酯做为萃取溶剂，在一定温度下，摇床振荡富集纯化CGTs。与文献相比较［5］，CGTs的纯度有很明显的提高。

图6 优化条件下提取次数对CGTs得率的影响

3 结论

本实验采用正交实验法优化CGTs的最佳工艺条件，确定最佳提取工艺为:超声功率200 W、丙酮体积分数60%、液料比24∶1mL∶g)、超声时间30 min、提取温度 40℃。经过 2次提取，CGTs得率达到719.6 mg/g，提取率为92.27%。乙酸乙酯萃取后CGTs纯度达到92.89%。与文献相比较［4］，超声波辅助提取处理时间不仅比水浴浸提法大大减少，而且CGTs得率有很明显的提高。

［1］李志国，杨文云，夏定久.中国五倍子研究现状［J］.林业科学研究，2003，16(6):760－767.

［2］傅春升，殷佳，朱青.五倍子的临床应用［J］.中药天地，2000，9(6):28－29.

［3］李秀萍，李春远，渠桂荣，等.五倍子的研究概况［J］.中医药学报，2002，30(3):72－74.

［4］孔琪.五倍子鞣质的提取及抑制亚硝化反应的初步研究［J］.应用科技，2005，32(9):62－64.

［5］帅益武，尤玉如，袁海娜.五倍子中鞣质的提取、分离纯化研究［J］.食品科技，2007，(6):125－128.

［6］陈笳鸿，汪咏梅，吴冬梅，等.单宁酸纯化技术的研究开发［J］.现代化工，2008，28(2):301－303.

［7］Cai Yi-zhong，Sun Mei，Xing Jie，et al.Structure-radical scavenging activity relationships of phenolic compounds from traditional Chinese medicinal plants［J］.Life Sciences，2006，78(25):2 872－2 888.

［8］刘现兵，杜镇镇，王冬.五倍子的体外抑菌作用研究［J］.中国实用医药，2008，3(7):96－97.

［9］Xiang P，Lin Y M，Lin P，et al.Effect of cationization reagents on the.matrix-assisted laser desorption/ionization time-of flight mass spectrum of Chinese gallotannins［J］.Journal of Applied Polymer Science，2007，105:859－864.

［10］Tian Fang，Li Bo，Ji Baoping，et al.Identification and structure-activity relationship of gallotannins separated from Galla chinensis［J］.LWT-Food Science and Technology，2009，42(7):1 289－1 295.

［11］Beasley T H，Ziegler H W，Bell A D.Determination and characterization of gallotannin by high performance liquid chromatography［J］.Analytical Chemistry，1977，49(2):238－243.

［12］Tian Fang，Li Bo，Ji Baoping，et al.Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts from Galla chinensis:The polarity affects the bioactivities［J］.Food Chemistry，2009，113(1):173－179.

［13］陈大全，王昌利，王剑波，等.正交实验优选元宝枫果壳中鞣质的提取工艺研究［J］.中草药，2006，37(12):1 816－1 817.

［14］黄秋森.有机溶剂提取萃取法生产茶多酚工业试验［J］.现代化工，2006，26(9):48－51.

［15］何兰，姜志宏.天然产物资源化学［M］.北京:科学出版社，2008:465－495.

［16］谭胜兵.超声波技术在天然产物提取中的应用［J］.食品工程，2007，2(6):47－50.

Orthogonal Array Design Tests for Optimizing Ultrasonicwave Extraction of Chinese Gallotannins

Jiang Kai1，Li Jian-ke2
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi＇an 710062，China)

Orthogonal array design was employed to optimize the ultrasonic extraction of Chinese Gallotannins(CGTs)，and the purification process of CGTs was also studied in this paper.The optimal extraction condition of CGTs were as follows:ultrasonic power was 200 W，60%acetone as extractant，liquid-to-solid ratio is 24∶1，extraction time was 30 min，temperature was 40℃;The maximum extraction efficiency obtained was 92.27%in two times extraction.The purification degree of CGTs was up to 92.89%with organic solvents.

orthogonal array design，Chinese Gallotannins(CGTs)，ultrasonicwave extraction，purification

硕士研究生(李建科教授为通讯作者，E-mail:jiankel@snnu.edu.cn)。

2010－06－24，改回日期:2010－08－16