芡实多糖的粗提取及其对羟自由基的清除效果

赵翾，李红良，叶倩雯

1(仲恺农业工程学院，轻工食品学院，广东广州，510225) 2(东莞市广益食品添加剂有限责任公司，广东东莞，523220)

芡实多糖的粗提取及其对羟自由基的清除效果

赵翾1，李红良2，叶倩雯1

1(仲恺农业工程学院，轻工食品学院，广东广州，510225) 2(东莞市广益食品添加剂有限责任公司，广东东莞，523220)

对芡实多糖的提取工艺进行了研究，并探讨了其对羟自由基的清除效果。通过单因素试验分别考察了浸提温度、浸提时间、乙醇浓度、水料比对芡实多糖提取量的影响，并确定了各因素的适用范围。利用Design-Expert软件设计了正交试验，并通过响应面分析法确定了芡实多糖的最佳提取工艺条件。结果表明:芡实多糖的最佳提取工艺条件为浸提温度92℃，浸提时间6 h，乙醇体积分数85%，水料比26∶1(mL∶g)，提取的芡实多糖提取量为0.62 mg/g，其对羟自由基的清除率为46.42%。

芡实，多糖，羟自由基，提取，清除，响应面法

芡实(Semen euryales)是睡莲科1年生水生草本植物芡(Euryale ferox Salisb)的种子成熟种仁［1］，是我国传统著名滋补防病保健中药材之一，具有养血安神、益肾固精、去湿健脾、止泻止滞等保健功效，对肾亏脾虚，小便失禁、白带崩下、慢性腹泻、轻度浮肿、腰腿关节痛等症均有显著的治疗作用。芡实营养丰富，蛋白质含量较丰富，氨基酸总量丰富且种类齐全，维生素含量也较为丰富;碳水化合物含量高达77%～78%，除6%左右为不溶性纤维素外，多数可被人体消化吸收，是比较理想的膳食纤维源［2～4］。

响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种寻找多因素系统中最佳条件并能研究各因素间交互作用的数学统计方法，该方法试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高，已经被广泛用于食品工业［5］。本试验利用中心组合设计(central composite design)优化芡实多糖的提取工艺，为进一步研究芡实多糖的组成、结构和其与生物学活性提供必要的科学数据。

1 材料与方法

1.1 原料

芡实(市售);浓硫酸、过氧化氢、硫酸亚铁、苯酚、水杨酸、无水乙醇等，均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

6202高速粉碎机(北京环亚天元机械技术有限公司)，HWS12型电子恒温水浴锅(上海恒科科学仪器有限公司)，BS110S型分析天平(常熟双杰测试仪器厂)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，LXJ-ⅡB型离心机(上海安亭科学仪器厂)，SpectrumLab54紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)。

1.3 芡实多糖提取方法

芡实多糖的提取采用水溶醇析法，其原理是根据多糖较易溶于水、碱、酸当中，而难溶于乙醇、石油醚、氯仿等溶剂的性质，用水先将粗多糖从芡实中提取出来，然后加入乙醇将其沉淀，同时除去单糖、低聚糖、甙类及生物碱等杂质［8］。具体操作流程如下:

芡实→粉碎过筛→芡实粉→热水浸提→浸提液→离心→上清液→真空浓缩→乙醇沉淀→粗多糖→测定多糖含量

1.4 多糖测定方法

本研究采用苯酚-硫酸法［9］测定多糖提取量。

1.4.1 葡萄糖标准曲线的制作

精密称取0.040 2 g葡萄糖，用蒸馏水溶解后定容到500mL，摇匀配制成80.4μg/mL的葡萄糖标准溶液，精确吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，分别置于试管中，加蒸馏水补至2mL。加5%苯酚试液1mL，摇匀。迅速滴加浓硫酸5mL，快速摇匀，放置5 min。置沸水浴中加热15 min，取出，用冷水迅速冷却至室温。同时用蒸馏水作空白，于490 nm处测定吸光度。

1.4.2 换算因子的计算

精密称取干燥至恒重的芡实多糖20 mg，用蒸馏水溶解后定容至100mL。吸取多糖溶液0.5mL，按照1.4.1测定吸光度，由回归方程计算出溶液中葡萄糖的含量，按下式计算换算因子。

式中:m为称取多糖的质量(μg)，c为多糖液中葡萄糖的含量(μg/mL)，D为多糖的稀释倍数。测定浓度为0.20μg/mL的芡实多糖吸光度为0.35，计算得换算因子为1.60。

1.4.3 芡实多糖提取量的计算

称量芡实粉末(过40目筛)，按料液比1∶30(g∶mL)加入蒸馏水，水浴浸提2 h，浸提液3 000 r/min离心15 min后取上清液，上清液用旋转蒸发仪浓缩到10mL，然后加入乙醇溶液沉淀，弃去上清液，沉淀加水溶解并定容至250mL。吸取0.5mL测定多糖的含量。

其中:m'，试液中葡萄糖的质量(μg);f，换算因子;V，测定时吸取的样品液体积(mL);250，稀释样液总体积;m，称取试样质量(g)。

1.4.4 羟自由基清除率的测定

本试验采用水杨酸作为羟自由基捕捉剂，在Smironff等报道的方法上进行改进。具体测定方法如下:在试管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2mL、不同浓度粗多糖溶液2mL、6 mmol/L H2O2溶液2mL，摇匀，静置10 min。再加入6 mmol/L水杨酸溶液2mL，摇匀，静置30 min后于510 nm处测得不同粗多糖浓度下的吸光度Ai，用水代替水杨酸时测得某浓度粗多糖的吸光度为本底吸光度Aj，用水代替抗氧化剂时测得的吸光度为对照吸光度A0。按下式计算得到羟自由基的清除率［10］。

2 结果与分析

2.1 浸提温度对多糖提取量及芡实多糖清除羟自由基效果的影响

称取2 g粉碎度为40目的芡实粉，加入60mL的蒸馏水，分别置于 50、60、70、80、90、100 ℃下浸提2 h，浸提离心后取上清液浓缩，加入3倍体积的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并测定多糖提取量及其对羟自由基的清除率。结果见图1。

图1 浸提温度对多糖提取量及芡实多糖清除羟自由基效果的影响

由图1可知，随着浸提温度的升高，芡实多糖的含量增加较明显，温度上升到90℃时，浸出的多糖提取量达到最大值;当温度超过90℃以后，多糖的含量呈现下降趋势。芡实多糖清除羟自由基的能力随浸提温度变化的趋势相同。故浸提温度选择在90℃左右比较适宜。

2.2 浸提时间对多糖提取量及对芡实多糖清除羟自由基效果的影响

称取2 g粉碎度为40目的芡实粉，加入60mL的蒸馏水，置于 70℃下分别浸提 1、2、3、4、5和6 h，浸提离心后取上清液浓缩，加入3倍体积的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并测定多糖提取量及其对羟自由基的清除率。结果见图2。

图2 浸提时间对多糖提取量及对芡实多糖清除羟自由基效果的影响

由图2可知，随着浸提时间的延长，芡实多糖的含量逐渐增加，浸提时间5 h时达到最大，然后随着浸提时间的延长，芡实多糖提取量开始下降。芡实多糖清除羟自由基的能力与芡实多糖提取随浸提时间变化的趋势相同。故浸提时间选择在5 h左右比较适宜。

2.3 乙醇浓度对多糖提取效果及对芡实多糖清除羟自由基效果的影响

称取2 g粉碎度为40目的芡实粉，加入60mL的蒸馏水，置于70℃下分别浸提2 h，浸提离心后取上清液浓缩，分别加入3倍体积的50%、60%、70%、80%、90%和100%乙醇沉淀12 h，加水溶解并测定多糖提取量及其对羟自由基的清除率。结果见图3。

由图3可知，随着乙醇浓度增加，芡实多糖的含量逐渐增加，乙醇体积分数为80%时达到最大，然后随着乙醇体积分数的增大，芡实多糖提取量开始下降。芡实多糖清除羟自由基的能力随乙醇浓度变化的趋势相同。故乙醇体积分数选择在80%左右比较适宜。

图3 乙醇浓度对多糖提取量及对芡实多糖清除羟自由基效果的影响

2.4 水料比对多糖提取效果及对芡实多糖清除羟自由基效果的影响

称取2 g粉碎度为40目的芡实粉，以水料比(mL∶g)为 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1 加入蒸馏水，置于70℃下浸提2 h，浸提离心后取上清液浓缩，加入3倍体积的70%乙醇沉淀12 h，加水溶解并测定多糖提取量及其对羟自由基的清除率，结果见图4。

图4 水料比对多糖提取量及对芡实多糖清除羟自由基效果的影响

从图4可知，随着水料比的增加，芡实多糖的含量逐渐增加，水料比为30∶1时达到最大，然后随着水料比的增大，芡实多糖提取量开始下降。芡实多糖清除羟自由基的能力随水料比变化的趋势相同。故水料比选择在30∶1左右比较适宜。

2.5 响应面分析

本试验采用Design-Expert7.1.6软件中的中心组合设计原理设计正交试验。根据单因素试验结果，选取浸提温度(A)、浸提时间(B)、乙醇体积分数(C)和水料比(D)4个因素作为试验因素设计试验，试验因素及水平见表1。试验设计见表2，共有19个试验点，其中16个析因点，3个中心点。

表1 正交试验因素与水平

表2 正交试验设计及结果

采用响应面分析法分析正交试验结果，得到分别以多糖提取量和羟自由基清除率为响应值的回归方程(1)和(2)。

对正交试验结果的方差分析见表3和表4。

从表3和表4可知，不论是以多糖提取量为响应值还是以羟自由基清除率为响应值，建立的数学模型均是显著的，失拟项不显著，说明建立的该数学模型可以很好地拟合试验情况，可用于试验结果的预测。即可以使用该数学模型推测试验结果。

表3 响应面ANOVA对多糖提取量分析结果

表4 响应面ANOVA对芡实多糖清除羟自由基分析结果

各因素对多糖提取量和羟自由基清除效果的影响由大到小依次为:乙醇浓度＞浸提时间＞水料比＞浸提温度。其中乙醇浓度对结果有非常显著的影响，其余因素对结果影响显著，浸提温度和乙醇浓度之间的交互作用及浸提时间和乙醇浓度之间的交互作用对结果有显著影响，而且浸提温度和水料比的交互作用对羟自由基的清除率也有显著性影响，它们之间的交互作用响应面图见图5～图9。

图5 浸提温度与乙醇浓度对芡实多糖提取量的影响

图6 浸提时间与乙醇浓度对芡实多糖提取量的影响

图7 浸提温度与乙醇浓度对芡实多糖羟自由基清除率的影响

图9 浸提时间与水料比对芡实多糖羟自由基清除率的影响

由以上数学模型得到4个较优的工艺条件(试验1～4)，将这4个条件和正交试验结果最佳的两个试验条件一起组成验证试验，以寻找芡实多糖提取的最佳工艺条件。验证试验设计见表5。

表5 验证试验设计表

根据验证试验结果，当浸提温度为92℃、浸提时间为6h、乙醇体积分数为85%、水料比为26∶1(mL∶g)时，芡实多糖的提取量达到最大0.63 mg/g，该条件下得到的芡实多糖对羟自由基的清除率也达到最大46.42%，与理论预测值非常接近。

4 结论

本试验通过单因素试验首先分别考察了浸提温度、浸提时间、乙醇浓度、水料比对芡实多糖提取量及多糖对羟自由基清除率的影响，并以此为依据，采用响应面法建立了数学模型，并获得了芡实多糖的最佳提取工艺条件为:浸提温度为92℃，浸提时间为6h，乙醇体积分数为85%，水料比为26∶1(mL∶g)，此条件下芡实多糖的提取量为0.63 mg/g，其对羟基自由基的清除率为46.42%。

［1］李彦连，张爱良.一种重要水生药用维管植物——芡实［J］.济宁师专学报，1998，19(6):27.

［2］张汆，薛连海，贾小丽，等.芡实的营养保健价值及其加工利用［J］.中国野生植物资源，2009，28(3):24－27.

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Preliminary Study on Extraction of Crude Polysaccharides from Semen euryales and Its Scavenging Activity of Hydroxyl Radical

Zhao Xuan1，Li Hong-liang2，Ye Qian-wen1
1(The College of Light Industry and Food，Zhongkai University of Agricultural and Engineering，Guangzhou 510225，China)2(Dongguan Guangyi Food Additive Industry Co，Ltd，Dongwan 523220，China)

The extraction of crude polysaccharides from Semen euryales was studied and the scavenging activity of hydroxyl radical of the polysaccharides was also discussed.The effects of extraction temperature，extraction time，ethanol concentration，liquid to solid ratio on the extraction yield of the crude polysaccharides and the scavenging activity of hydroxyl radical of the polysaccharides were investigated.Single factor experiments and the orthogonal experiments was designed by Design-Expert software.The model was established by the response surface methodology analysis and the optimal extraction condition was obtained as follows:extraction temperature 92℃，extraction time 6h，ethanol concentration 85%，liquid to solid ratio 26∶1，the extraction yield of crude polysaccharides was 0.63mg/g and the scavenging activity of hydroxyl radical was 46.42%.

Semen euryales，polysaccharide，hydroxyl radical，extraction，scavenging activity，response surface methodology

博士，讲师。

2010－07－06，改回日期:2010－10－15