不同鼠龄的人多巴胺D5F173L突变基因转基因高血压小鼠血压及心脏结构与功能分析

董 伟，杨志伟，曹兴水，姚 璐，张 旭，高 珊，张海涛，张连峰

(中国医学科学院 北京协和医学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

不同鼠龄的人多巴胺D5F173L突变基因转基因高血压小鼠血压及心脏结构与功能分析

董 伟，杨志伟，曹兴水，姚 璐，张 旭，高 珊，张海涛，张连峰

(中国医学科学院 北京协和医学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的 通过对不同年龄多巴胺D5F173L突变基因及D5正常基因转基因小鼠的血压和心脏结构与功能进行分析，了解多巴胺D5受体在高血压发生发展过程中的作用。方法 利用无创血压测量仪和高分辨率小动物超声系统检测两种转基因小鼠的血压和左心室壁厚度、左心室内径、左心室容积、射血分数、短轴缩短率和左心室质量等心脏功能指标。结果 D5F173L转基因小鼠4月龄、6月龄、16月龄时收缩压、舒张压都明显高于D5转基因小鼠;4月龄、6月龄的D5F173L转基因小鼠与D5转基因小鼠相比舒张期和收缩期左室壁厚度均明显增大、左室内容积均明显变小、左心室重量增加;16月龄的D5F173L转基因小鼠与D5转基因小鼠相比左心室前壁增厚、心腔内径缩短，心腔容积下降、心室重量增加、射血分数提高、短轴缩短率提高;在18月龄时D5F173L转基因小鼠相比于D5转基因小鼠左心室收缩期前壁厚度增加，后壁厚度减少，舒张期前壁厚度增加，后壁厚度减少;另外在18月龄时D5F173L转基因小鼠与其16月龄时相比，射血分数、短轴缩短率明显降低，收缩期左心室容积明显增大。结论 D5F173L转基因小鼠的血压及心脏功能与结构的分析结果符合原发性高血压的特征。D5F173L转基因小鼠可作为原发性高血压动物模型。

高血压;多巴胺D5受体;心脏超声;小鼠，转基因

原发性高血压(primary hypertension)及其并发症是影响人类健康的主要原因之一。过去20～30年的研究发现，多巴胺在调节钠排泄及血压方面具有重要的作用［1-3］。多巴胺(dopamine)是通过多巴胺受体(dopamine receptor)发挥其功能的，多巴胺受体为一种G蛋白偶联受体，分为D1类和D2类亚家族受体。D1类受体包括D1和D5受体(在大鼠中又被称为 D1A和 D1B)，刺激腺苷酸环化酶活性、增加cAMP的产生;而D2类受体包括 D2、D3和 D4受体，则抑制腺苷酸环化酶活［4］。D5受体对多巴胺有较强的亲和力，且在没有多巴胺的情况下，仍发挥功能，即自身具有持续活性，因此D5受体对高血压发病的作用更为重要［5］。研究还发现 D5受体基因位点(chromosome 4P15.1-16.1)与原发性高血压有相关性［6-9］。人D5受体基因多态性能引发功能异常的，包括 L88F、F173L、A269V、P330Q、C335X、N351D、S390G和 S453G［10］。我们建立了人多巴胺D5F173L突变基因及D5转基因小鼠［11］。本文主要探讨多巴胺D5受体突变基因在不同年龄对小鼠血压和心脏结构与功能的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验分为两组，第一组转人多巴胺受体D5突变基因D5F173L转基因小鼠，简称D5F173L;第二组转人多巴胺受体 D5野生型 D5转基因小鼠，简称 D5。每组小鼠各6只，雌雄各半，由实验动物研究所遗传中心提供［SCXK京2009-0008］。

1.2 血压测量

在4月龄、6月龄和16月龄对两组实验鼠进行血压测量。使用Softron智能无创血压计BP-98A测量血压，选择与小鼠大小合适的鼠袋，鼠网，将小鼠头部朝前，前端朝上放入鼠袋，包紧小鼠臀部将鼠尾露出;将小鼠于38℃温桶中预热10 min，然后将加压感应器正确置于尾根处;保持小鼠在安静和清醒状态下数秒后开始测量小鼠血压;每只小鼠测量3次，记录3次平均值为测量结果。

1.3 超声分析

在4月龄、6月龄、16月龄、18月龄对两组实验鼠进行心脏超声检测。实验小鼠用三溴乙醇注射麻醉后(0.18 mL/10 g体重)，用脱毛剂脱去胸部体毛，置于检测台上，将台温设定为40℃，小鼠四肢用医用胶布固定于涂有导电胶的电极上，记录生理指标。用VisualSonics Vevo770操作系统和专门用于小鼠心脏的RMV707B高频超声探头，进行B型、M型超声，血流多普勒的检测。通过 VisualSonics Vevo770高分辨率小动物超声系统的软件进行数据分析。

2 结果

2.1 D5F173L突变基因转基因小鼠高血压可持续到老年

血压测量结果显示，在4月龄、6月龄、16月龄三个时间点，D5F173L收缩压较D5分别高7.2%(P＜0.05)、11.7%(P ＜0.05)、8.9%(P ＜0.05)(图1A);D5F173L舒张压较 D5分别高16.2%(P＜0.05)、8.9%(P ＜ 0.05)、22%(P ＜0.05)(图1B)。

2.2 D5F173L突变基因表达影响基因转基因小鼠心脏结构

超声检测结果显示，在4月龄、6月龄、16月龄、18月龄4个时间点，D5F173L的收缩期左心室前壁较D5分别增厚 2.3%(P＞0.05)、9.5%(P＜0.05)(图 2)、14.5%(P ＜0.05)、14.3%(P ＜0.05)，收缩期左心室后壁分别增厚82%(P＜0.01)、75%(P＜0.01)(图 2)、15.7%(P ＜0.05)、-12%(P ＜0.05)，舒张期左心室前壁分别增厚 1.1%(P＞0.05)、19.3%(P ＜0.05)(图 2)、1.0%(P ＞0.05)、18.3%(P＜0.05)，舒张期左心室后壁分别增厚91%(P ＜0.05)、105%(P ＜0.05)(图 2)、1.1%(P＞0.05)、-16.28%(P＜0.05)(图 3A);D5F173L的收缩期左心室容积较D5分别缩小53.7%(P＜0.05)、85.3%(P ＜0.01)、30.4%(P ＜0.05)、11%(P＞0.05)(图3B);D5F173L的收缩期左心室内径较D5分别缩短 26.2%(P＜0.01)、53%(P＜0.01)(图 2)、15.9%(P ＜0.05)、3.4%(P ＞0.05)(图3C);D5F173L的左心室重量较D5分别增加34%(P＜0.05)、26.8%(P ＜0.05)、6.3%(P ＞0.05)、5.4%(P＞0.05)(图3D)。

2.3 D5F173L突变基因表达影响基因转基因小鼠心脏功能

在心脏功能方面D5F173L的短轴缩短率较D5分别增加 30.2%(P＜0.05)、38.8%(P＜0.01)、30.4%(P＜0.05)、1.6%(P＞0.05)(图 4A);D5F173L的射血分数较 D5分别增加 8.8%(P＞0.05)、20.1%(P ＜0.05)、11.3%(P ＜ 0.05)、1.2%(P＞0.05)(图 4B)。在 18月龄时 D5F173L与其16月龄时相比，射血分数降低17.9(P＜0.05)、短轴缩短率降低27.0%(P＜0.05)(图5A)，收缩期左心室容积增大24.6%(P＜0.05)(图5B)。

图1 不同年龄小鼠血压的测定Fig.1 Determination of the blood pressure of the transgenic mice at different ages

图2 M型超声测量小鼠左心室壁厚及心室内径Fig.2 Determination of the left ventricular wall thickness and ventricular diameter using M-mode ultrasonography

3 讨论

高血压是多种心血管疾病的重要危险因素之一，心脏作为靶器官之一与其存在着密切的关系。左心室肥厚(left ventricular hypertrophy，LVH)是高血压病早期最常见的心脏改变。高血压病的发展过程中，心脏为了克服持续性增高的外周阻力，以维持足够的心搏出量，心室肌收缩力必须相应增加，从而发生心肌细胞代偿性增大、细胞间质水肿、胶原纤维增生等，随着病程进展，心肌纤维化导致心肌僵硬度的增加，最终导致心脏构型和功能的改变，即心室重塑(ventricular remodeling)。这些变化始发于心肌损伤、压力超负荷及容量超负荷改变［12］。这些结构变化的初始目的是保持有效的心功能，但长时间后则是有害的，最终导致心力衰竭［13］。高血压代偿性左室肥厚呈对称性的向心性肥厚，室壁和室间隔增厚，心室容积和室壁张力基本正常，重量体积比增高。晚期演变为离心性肥厚，心腔扩大，左室球状改变，心功能衰竭［12］。

D5F173L转基因小鼠4月龄、6月龄、16月龄时，收缩压与舒张压都明显高于 D5转基因小鼠，表明多巴胺D5F173L突变使其对血压的调节功能减弱，压力超负荷状态持续存在。4月龄、6月龄的D5F173L转基因小鼠与D5转基因小鼠相比舒张期和收缩期左室壁厚度均明显增大、左室内容积均明显变小、左心室重量增加，射血分数和短轴缩短率增加并且上述变化有随时间渐进的趋势，表明血压升高同时伴有左室心肌肥大、室腔减小、进行性增重呈现向心性肥厚及为了对抗压力超负荷状态心肌收缩功能增强，心功能提升等代偿性改变。16月龄的D5F173L转基因小鼠与D5转基因小鼠相比左心室前壁增厚、心腔内径缩短，心腔容积下降、心室重量增加、射血分数提高、短轴缩短率提高提示心脏仍处于代偿期，但是与 4、6月龄的心功能分析结果比较，D5F173L转基因小鼠相比于D5转基因小鼠在上述各项数据上均出现降低趋势，表明D5F173L转基因小鼠心脏已经出现失代偿的趋势。在18月龄时D5F173L转基因小鼠相比于D5转基因小鼠左心室收缩期前壁厚度增加，后壁厚度减少，舒张期前壁厚度增加，后壁厚度减少，其余各项数据均无明显差异，且与上述指标变化无明显相关性;另外在18月龄时D5F173L转基因小鼠与其16月龄时相比射血分数、短轴缩短率明显降低，收缩期左心室容积明显增大，提示D5F173L转基因小鼠的左室肥厚呈非对称性，心腔扩大，心功能下降，出现失代偿表型。

图3 M型超声测量转基因小鼠心脏结构变化Fig.3 Determination of the cardiac structural changes in the transgenic mice by M-mode ultrasonography

图4 转基因小鼠心脏功能分析Fig.4 Comparison of the heart function of 4-month-old，6-month-old，16-month-old and 18-month-old D5F173Land D5 transgenic mice

图5 转基因小鼠心脏功能分析Fig.5 Cardiac function analysis of the transgenic mice

综上，D5F173L转基因小鼠的血压及心脏功能与结构的分析结果符合原发性高血压的特征，D5F173L转基因小鼠可以作为原发性高血压小鼠模型，用于研究高血压引起的左心室肥厚。

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Analysis of the Blood Pressure and Cardiac Structure and Function in Human Dopamine D5F173LTransgenic Mice at Different Ages

DONG Wei，YANG Zhi-wei，CAO Xing-shui，YAO Lu，ZHANG Xu，GAO Shan，ZHANG Hai-tao，ZHANG Lian-feng
(Institute of Laboratory Animal Science，Peking Union Medical College/Chinese Academy of Medical Sciences，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To analyze the role of D5F173Lmutation in the development of hypertension，and to detect the blood pressure，cardiac structure and function changes in the D5F173Lmutation gene and the D5 gene transgenic mice at different ages.Methods The blood pressure was detected with an intelligent non-invasive blood pressure measuring instrument(SoftronTM).The cardiac structure and function were examined with a high-resolution small animal ultrasound system(Sonics Vevo770).Results Both systolic and diastolic blood pressures of the D5F173Ltransgenic mice were significantly higher than that in the 4-month，6-month and 16-month old D5 transgenic mice.Compared with the 4-month and 6-month old D5 transgenic mice，the ventricular wall thickness and ventricular mass of the D5F173Ltransgenic mice wasincreased，while the left ventricular volume decreased.Compared with the D5 transgenic mice at the age of 16 months，the left ventricular wall thickness，cardiac chamber diameter shortening and cardiac chamber volume in the D5F173Ltransgenic mice were decreased，while the ventricular weight，ejection fraction and fractional shortening rate were increased.The D5F173Ltransgenic mice showed an obvious remodeling compared to 18-month old D5 transgenic mice，with a decease of the left ventricular systolic anterior wall and posterior wall，and increase of the diastolic wall.Conclusion The changes of blood pressure，cardiac function and cardiac remodeling of the D5F173Ltransgenic mice show a similar phenotype with that of human primary hypertension.The D5F173Ltransgenic mouse can be used as a primary hypertension animal model.

Hypertension;Dopamine D5 receptor;Echocardiography;Transgenic mice

R331.1

A

1671-7856(2010)08-0001-05

2009-12-22

卫生部项目，实验动物和人类疾病动物模型资源扩展(200802036)和十一五新药专项支持(2009ZX09501-026)。

董伟，男，电话：010-87778442。

张连峰，E-mail： Zhanglf@cnilas.org。