基质金属蛋白酶－2、－9及其组织抑制剂－1在大鼠肺组织中的增龄变化

李小莹，王 蓉，聂秀红，李 林，畅 怡，赵松林，万岁桂，孙雪梅，徐 娟

(1.首都医科大学宣武医院呼吸内科;2.首都医科大学宣武医院中心实验室，神经变性病教育部重点实验室;3.首都医科大学宣武医院血液科流式细胞室，北京 100053)

基质金属蛋白酶－2、－9及其组织抑制剂－1在大鼠肺组织中的增龄变化

李小莹1，王 蓉2，聂秀红1，李 林2，畅 怡1，赵松林1，万岁桂3，孙雪梅3，徐 娟3

(1.首都医科大学宣武医院呼吸内科;2.首都医科大学宣武医院中心实验室，神经变性病教育部重点实验室;3.首都医科大学宣武医院血液科流式细胞室，北京 100053)

目的 研究基质金属蛋白酶(MMPs)－2、－9及组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)－1在大鼠肺组织中的增龄性变化规律。方法 不同月龄(1月龄、3月龄、12月龄、18月龄、24月龄)雄性清洁级(SD)大鼠47只分为5组，按月龄取实验大鼠的右下叶肺组织，用流式细胞术检测MMP－2、MMP－9及TIMP－1的表达水平，进行定量分析。结果 MMP－2、MMP－9和 TIMP－1均随着月龄的增长呈先降后升波谷型曲线变化;3月龄、12月龄和18月龄MMP－2、MMP－9 和 TIMP－1 均较 1 月龄明显下降，且以12 月龄为最低值;24 月龄 MMP－2、MMP－9 和 TIMP－1 均较 1 月龄上升。MMP－2/TIMP－1比值和MMP－9/TIMP－1比值均随着月龄的增长呈先升后降波峰型曲线变化;12月龄和18月龄均较1月龄明显升高，且以18月龄为最高点;3月龄的 MMP－2/TIMP－1较1月龄有所上升，3月龄的 MMP－9/TIMP－1与1月龄持平;24月龄的 MMP－2/TIMP－1和MMP－9/TIMP－1较1月龄也有不同程度上升。结论 大鼠肺组织中MMPs及其抑制剂TIMPs随月龄的增长，呈特征性变化规律。

基质金属蛋白酶;基质金属蛋白酶组织抑制剂;大鼠肺组织;增龄;流式细胞术

肺脏老化是人类衰老的一部分，在人体各器官中，肺是最早出现老化从而功能衰退的器官之一。目前，有关肺老化的机理所知尚少。肺老化的发生是由于肺内细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)发生衰老性改变的结果［1］。在正常肺组织中ECM能维持肺泡结构，它的合成与降解保持动态平衡，这对于保证正常肺功能非常重要;平衡破坏时，将会产生肺结构改变。构成ECM的IV型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等成分均为基质金属蛋白酶(matrix met alloproteinases，MMPs)的作用底物，能被MMPs降解。基质金属蛋白酶(MMPs)及其组织抑 制 剂 (tissue inhibitors ofmet alloproteinases，TIMPs)的失衡可导致ECM的动态平衡被破坏。目前系统研究MMPs、TIMPs与肺脏老化的报道较少。为此，我们通过观察不同月龄大鼠肺组织中 MMP－2、－9及其抑制剂 TIMP－1的表达，研究其在大鼠肺组织中的增龄性变化规律，探讨肺老化可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

实验用雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠47只，购自北京大学医学部实验动物科学部［SCXK(京2002－0001)］。按不同月龄将大鼠分为5组:1月龄(1M)组10只;3月龄(3M)组9只;12月龄(12M)组11只;18月龄(18M)组11只;24月龄(24M)组6只。按昼夜时程，在室温及稳定湿度条件下，用全价配合饲料喂养。

1.2 主要试剂

山羊抗大鼠 MMP－9抗体 IgG、山羊抗大鼠MMP－2抗体 IgG、山羊抗大鼠 TIMP－1抗体 IgG及间接免疫荧光标记物异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的兔抗山羊 IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS)(山东济南希森美康医用电子有限公司);1∶10稀释红细胞裂解液(美国 BD公司);4%多聚甲醛(paraformaldehyde)溶液为自制。

1.3 实验仪器

美国BD公司生产的FCS Calibur流式细胞仪，激发光源为氩离子激光器，输出功率15 mW，激发光波长为488 nm。所测数据采用Cell Quest软件进行分析。

1.4 标本采集

按月龄取实验大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取大鼠的右下叶肺组织用4%多聚甲醛溶液固定。

1.5 标本制备

单细胞悬液的制备［2－3］:将 4% 多聚甲醛溶液固定的肺组织以网搓法制备单细胞悬液。4℃冰箱保存48 h内上流式细胞仪进行检测。

1.6 流式细胞仪检测方法及定量分析

流式细胞仪检测术(flow cytometry，FCM)［2－3］。采用流式细胞仪进行单参数检测，所测数据经Cell Quest软件进行分析，细胞的每一个单参数测量数据用直方图来显示，图中横坐标表示荧光信号相对强度值，其单位是“道数”(Channel);纵坐标表示细胞数。确定阳性峰后，以阳性峰的平均荧光强度表示MMP－2、MMP－9 及 TIMP－1 的表达水平。

1.7 统计学方法

用SPSS11.5软件包处理数据，进行统计分析。正态性检验采用T检验;各组间进行单因素方差分析，若差异有显著性意义，进一步做两两比较 q检验。计量资料以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异具有显著意义。

2 结果

2.1 MMP-2、MMP-9在不同月龄大鼠肺组织中的表达

MMP－2和MMP－9均随着月龄的增长呈先降后升波谷型曲线变化;3月龄、12月龄和18月龄MMP－2和 MMP－9均较1月龄明显下降，且以 12月龄为最低值，差异有统计学意义(P＜0.05);24月龄MMP－2和 MMP－9均较1月龄上升，但差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

表1 MMP－2、MMP－9在不同月龄大鼠肺组织中的表达(±s)Tab.1The expression of MMP－2 and MMP－9 in lung tissue of rats at different ages(±s)

表1 MMP－2、MMP－9在不同月龄大鼠肺组织中的表达(±s)Tab.1The expression of MMP－2 and MMP－9 in lung tissue of rats at different ages(±s)

注:❶与组1比较 P＜0.05;❷与组3比较 P＜0.05;❸与组12比较 P＜0.05;❹与组18比较 P＜0.05;❺与组24比较 P＜0.05Note:❶vs.the 1－month group，P ＜0.05;❷vs.the 3－month group，P ＜0.05;❸vs.the 12－month group，P ＜0.05;❹vs.the 18－month group，P ＜0.05;❺vs.the 24－month group，P ＜0.05

Group MMP－2 MMP－9 1月龄组 1－month(n=10)129.44±22.45❷❸❹ 122.83±20.83组别❷❸❹3月龄组 3－month(n=9)72.85±16.75❶❹❺67.82±20.46❶❹❺12月龄组 12－month(n=11)72.20±17.48❶❹❺ 66.98±18.43❶❹❺18月龄组 18－month(n=11)100.84±18.94❶❷❸❺ 88.95±15.07❶❷❸❺24月龄组 24－month(n=6)141.52±20.02❷❸❹ 142.60±31.81❷❸❹

2.2 TIMP-1在不同月龄大鼠肺组织中的表达

TIMP－1随着月龄的增长呈先降后升波谷型曲线变化;3月龄、12月龄和18月龄TIMP－1均较1月龄明显下降，且以12月龄为最低值，差异有统计学意义(P＜0.05);24月龄 TIMP－1较1月龄上升，但差异无显著性(P＞0.05)。见表2。

表2 TIMP－1在不同月龄大鼠肺组织中的表达(±s)Tab.2 The expression of TIMP－1 in lung tissue of rats at different ages(±s)

表2 TIMP－1在不同月龄大鼠肺组织中的表达(±s)Tab.2 The expression of TIMP－1 in lung tissue of rats at different ages(±s)

注:❶与组1比较 P＜0.05;❷与组3比较 P＜0.05;❸与组12比较 P＜0.05;❹与组18比较 P＜0.05;❺与组24比较 P＜0.05Note:❶vs.the 1－month group，P ＜0.05;❷vs.the 3－month group，P＜ 0.05;❸vs.the 12－month group，P ＜ 0.05;❹vs.the 18－month group，P ＜0.05;❺vs.the 24－month group，P ＜0.05

组别Group TIMP－1 1月龄组 1－month(n=10)150.34±21.78❷❸❹3月龄组 3－month(n=9)83.25±22.30❶❺12月龄组 12－month(n=11)73.81±23.06❶❺18月龄组 18－month(n=11)92.32±18.52❶❺24月龄组 24－month(n=6)161.13±43.02❷❸❹

2.3 MMP-2/TIMP-1、MMP-9/TIMP-1 在不同月龄大鼠肺组织中的表达

MMP－2/TIMP－1 比值和 MMP－9/TIMP－1 比值均随着月龄的增长呈先升后降波峰型曲线变化;12月龄和18月龄均较1月龄明显升高，且以18月龄为最高点，差异有统计学意义(P＜0.05);MMP－2/TIMP－1 的 3 月龄较 1 月龄有所上升，MMP－9/TIMP－1的3月龄与1月龄持平，差异均无显著性 (P＞0.05);MMP－2/TIMP－1 和 MMP－9/TIMP－1 的 24 月龄较1月龄也有不同程度上升，但差异均无显著性(P＞0.05)。见表3。

表3 MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 在不同月龄大鼠肺组织中的表达(±s)Tab.3 The ratios of MMP－2/TIMP－1 and MMP－9/TIMP－1 expressions in the lung tissues of rats at different ages(±s)

表3 MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 在不同月龄大鼠肺组织中的表达(±s)Tab.3 The ratios of MMP－2/TIMP－1 and MMP－9/TIMP－1 expressions in the lung tissues of rats at different ages(±s)

注:❶与组1比较 P＜0.05;❷与组3比较 P＜0.05;❸与组12比较 P＜0.05;❹与组18比较 P＜0.05;❺与组24比较 P＜0.05Note:❶vs.the 1－month group，P ＜0.05;❷vs.the 3－month group，P＜ 0.05;❸vs.the 12－month group，P ＜ 0.05;❹vs.the 18－month group，P ＜0.05;❺vs.the 24－month group，P ＜0.05

Group MMP－2/TIMP－1 MMP－9/TIMP－1 1月龄组 1－month(n=10)0.86±0.11❸❹ 0.82±0.10组别❸❹3月龄组 3－month(n=9)0.89±0.07❸❹ 0.82±0.14❹12月龄组 12－month(n=11)1.00±0.12❶❷❹ 0.92±0.10❶18月龄组 18－month(n=11)1.10±0.05❶❷❸❺0.97±0.11❶❷24月龄组 24－month(n=6)0.91±0.13❹0.90±0.10

3 讨论

人的老化是一个漫长的过程，从出生、生长、发育、成熟、衰老到死亡是一个必然的不可逆转的连续的渐进过程。人体发育至20～30岁成熟，体细胞数和器官重量不再增加，各项生理功能达到峰值。此后开始衰退，并随增龄而加速。作为人体重要组成部分的呼吸系统亦不例外地经历着这一过程［4］。

王蓉等［5］应用电子显微镜对不同年龄组大鼠的海马和皮层神经元超微结构进行了观察，研究表明其存在明显的随增龄变化趋势。但肺组织增龄性变化规律报道很少。曾有文献报道［1］肺老化时肺内纤维连接蛋白增多，层粘连蛋白及IV型胶原减少，肺透明质酸减少，硫酸肝素糖蛋白增多，提示肺老化不仅是肺细胞的衰老，肺细胞外基质(ECM)也发生了相应改变。

MMPs是一组具有相同功能、结构高度同源、依赖锌离子的内肽酶的总称，主要作用是降解ECM和基底膜［6］。TIMPs是 MMPs的天然特异性抑制因子，MMPs－TIMPs平衡在协调 ECM成分的合成与降解过程，维持ECM内环境的稳定和结构完整中发挥重要作用。明胶酶是MMPs家族成员之一，包括明胶酶 A(MMP－2)和明胶酶 B(MMP－9)两种成员，明胶酶的底物包括明胶、IV、V、VII、X型胶原和纤连蛋白，在体内明胶酶可高效降解基底膜的主要结构成分 IV 型胶原［7－8］。MMP－9 主要在巨噬细胞和中性粒细胞表达，在成纤维细胞、支气管黏膜上皮细胞和肺泡上皮细胞中也有少量表达;MMP－2主要在巨噬细胞表达，此外在成纤维细胞、支气管粘膜上皮细胞和肺泡上皮细胞以及基质中也有一定的表达［9］。明胶酶及其抑制物表达失衡是引起ECM异常积聚的重要因素之一［10－11］。

有实验研究对不同周龄(4周龄和9周龄)大鼠不同组织中的明胶酶活性进行了检测，结果表明，大鼠心、肺、肝、肾、主动脉中以明胶酶B为主，低龄大鼠(4周龄)各组织中的明胶酶活性均高于高龄大鼠(9周龄)的相应组织，这可能与前者胶原代谢速度较快有关［8］。本研究结果显示，大鼠肺组织中明胶酶MMP－2和 MMP－9均随着月龄的增长呈先降后升波谷型曲线变化;3月龄、12月龄和18月龄MMP－2和MMP－9均较1月龄明显下降，且以12月龄为最低值;该结果与上述实验研究中低龄大鼠(4周龄)肺组织中的明胶酶活性均高于高龄大鼠(9周龄)肺组织的结果相一致。

有研究表明［1］，随年龄增长，肺泡上皮基底膜逐渐增厚，尤以老年阶段明显;老年大鼠肺基底膜Ⅳ型胶原和层粘连蛋白减少。结合本实验结果24月龄老年大鼠肺组织中 MMP－2和 MMP－9均高于低龄大鼠，推测老年大鼠肺基底膜IV型胶原和层粘连蛋白减少，可能与 MMP－2和 MMP－9在老年大鼠肺组织中增高，降解肺基底膜IV型胶原和层粘连蛋白增多有关。邱忠民等［12］的研究发现老年大鼠肺泡Ⅱ型细胞基底膜也增厚，提示老年大鼠肺泡II型细胞对基底膜ECM代谢能力发生了改变，致使肺泡上皮基底膜ECM出现过度堆积;老年大鼠肺泡上皮基底膜层粘连蛋白含量下降，纤维连接蛋白增多，导致肺泡修复能力的异常，致使修复不及时或不完全，参与老年肺形态结构和功能改变的形成。

Thrailkill［13］对 189 名 2～18 岁的儿童及青少年血清MMP－2进行检测，结果表明与年龄呈负相关，与本实验中3月龄大鼠肺组织中 MMP－2均较1月龄明显下降的结果相一致。新近有研究显示［14］，正常人血清MMP－2水平在20～29岁较高，30～39岁有所下降，40～69岁后随年龄的增加而升高，到70～80岁下降，此结果与本研究大鼠肺组织中MMP－2随月龄变化的规律相似，但血清中MMP－2水平是否与肺组织中MMP－2的表达相关需进一步研究证实。

TIMP－1具有多种生物学功能，能特异性与MMP－2、MMP－9催化活化中心的锌离子结合，而封闭其催化中心，从而使 MMP－2、MMP－9失去降解 ECM 的活性。本研究结果显示，大鼠肺组织中TIMP－1随着月龄的增长呈先降后升波谷型曲线变化;3月龄、12月龄和18月龄TIMP－1均较1月龄明显下降，且以12月龄为最低值;24月龄TIMP－1较3月龄、12月龄和18月龄明显上升。大鼠肺组织中TIMP－1增龄性变化的机制仍不清楚，尚需进一步研究。

正常情况下，MMP－2 及 MMP－9 分别与 TIMP－1是以1∶1的比例一起释放的，二者之间的平衡保持了正常基质和内环境的稳定。MMP－2和 MMP－9可降解IV型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等，而TIMP－1 可抑制 MMP－2 和 MMP－9，从而抑制基质降解，引起基质沉积。MMP－2、MMP－9 增多，使降解细胞外基质增多，且 TIMP－1反馈性增多，以避免组织破坏过度。同时高浓度的 TIMP－1能促进 ECM沉积，导致异常的胶原修复。本实验结果显示:MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 随着月龄的增长呈先升后降波峰型曲线改变，12月龄和18月龄均较1月龄明显升高，且以18月龄为最高点。老龄大鼠肺组织中 MMP－2/TIMP－1、MMP－9/TIMP－1 随着月龄的增加而变化的确切原因有待深入研究。

本研究探讨了大鼠肺组织中MMPs、TIMPs增龄性变化的规律，可以得出以下结论:⑴ 大鼠肺组织中 MMP－2、MMP－9 和 TIMP－1 均随着月龄的增加呈先降后升波谷型曲线变化;⑵ MMP－2/TIMP－1及MMP－9/TIMP－1比值均随着月龄的增加呈先升后降波峰型曲线变化;⑶ 大鼠肺组织中MMPs及其抑制剂TIMPs随月龄的增长，呈特征性变化规律。

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［2］孙晓明，尹格平.实体瘤组织细胞粘附分子流式细胞研究方法的建立［J］.中华医学检验杂志，1997，20(1):9－11.

［3］宋平根，李素文.流式细胞术的原理和应用［M］.北京:北京师范大学出版社.1992:64－139.

［4］黄念秋，吴善.现代老年呼吸病学［M］.北京:人民军医出版社.1998:1－9.

［5］王蓉，唐玉，张丽.大鼠海马神经元突触超微结构的增龄变化［J］.中国比较医学杂志，2009，19(4):18－22.

［6］Maskos K，Bode W.Structural basis of matrix met alloproteinases and tissue inhibitors of met alloproteinases［J］.Mol Biotechnol，2003，25(3):241－266.

［7］Chakrabarti S，Patel KD.Matrix met alloproteinase－2(MMP－2)and MMP－9 in pulmonary pathology［J］.Exp Lung Res，2005，31(6):599－621.

［8］孙红霞，温进坤，韩梅.大鼠不同年龄和组织中明胶酶活性的比较研究［J］.河北医科大学学报，1998，6:350－351.

［9］Segura－Valdez L，Pardo A，Gaxiola M， et al. Upregulation of gelatinases A and B， collagenases 1 and 2， and increased parenchymal cell death in COPD［J］. Chest，2000，117:684－694.

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［12］邱忠民，何冰，宋明臣，等.老年大鼠肺泡II型细胞细胞外基质成分和基底膜厚度的变化［J］.北京医科大学学报，2000，32(6):555－566.

［13］Thrailkill KM，Moreau CS，Cockrell G，et al.Physiological matrix met alloproteinase concentrations in serum during childhood and adolescence，using Luminex Multiplex technology［J］.Clin Chem Lab Med，2005，43(12):1392－1399.

［14］张红，罗湘杭，谢辉，等.基质金属蛋白酶－1、－2与女性年龄、骨转换生化指标及骨密度的关系［J］.中华内科杂志，2006，45(4):306－309.

Changes of MMP-2，MMP-9 and TIMP-1 Expression in the Lung Tissue of Rats with Increasing Age

LI Xiao－ying1，WANG Rong2，NIE Xiu－hong1，LI Lin2，CHANG Yi1，ZHAO Song－lin1，WAN Sui－gui3，SUN Xue－mei3，XU Juan3
(1.Department of Respiration Medicine;2.Central Laboratory，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，and Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of the Ministry of Education;3.Flow Cytometry Laboratory，Department of Hematology，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China)

Objective To investigate the changes of matrix met alloproteinases(MMPs)－2，－9 and tissue inhibitors of met alloproteinases(TIMP－1)in the lung tissue of rats with increasing age.Methods 47 male SD rats were assigned into five groups at different ages.Tissue samples were taken from the lower right lobe of the lung.Unicellular suspension was prepared for detection of MMP－2，MMP－9 and TIMP－1 by flow cytometry(FCM).Results The expressions of MMP－2，MMP－9 and TIMP－1 in the rats of 3－month，12－month and 18－month groups were significantly decreased compared withthat in the 1－month group.Those in 24－month group showed slightly higher than that of 1－month group，but with no significant difference between these two groups.The ratios of MMP－2/TIMP－1 and MMP－9/TIMP－1 in the 12－month and 18－month groups were significantly higher than that of 1－month group，while the ratios in 3－month and 24－month groups were slightly higher than that in the 1－month group.Conclusions MMPs and TIMPs in lung tissue of rats show characteristic changes with aging.

Matrix met alloproteinase;Tissue inhibitorofmet alloproteinase;Ratlung;Increasing age;Flow cytometry

R－33

A

1671－7856(2010)08－0010－05

2010－04－08

国家重点基础研究计划－973计划项目(2003CB517104)。

李小莹(1963－)，女，硕士，副主任医师。

聂秀红(1963－)，女，博士，主任医师，教授，研究方向:肺老化机制研究，电话:010－83198668，E－mail:xwyyhxk@126.com。