乙型脑炎病毒(JEV)ELISA检测方法的建立

2010-09-17高正琴岳秉飞贺争鸣

中国比较医学杂志 2010年8期

关键词：抗原特异性阴性

王吉，卫礼，巩薇，高正琴，岳秉飞，贺争鸣

(中国药品生物制品检定所，国家实验动物微生物、遗传检测中心，北京 100050)

乙型脑炎病毒(JEV)ELISA检测方法的建立

王吉，卫礼，巩薇，高正琴，岳秉飞，贺争鸣

(中国药品生物制品检定所，国家实验动物微生物、遗传检测中心，北京 100050)

目的建立猪乙型脑炎病毒(JEV)抗体ELISA检测方法。方法培养BHK21细胞，接种JEV病毒，制备BHK21正常抗原和JEV特异抗原，滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度，并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验。结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为0.2 μg/mL、10 μg/mL和1∶20000;正常、特异抗原批内变异系数分别为8.3%和6.4%，批间平均变异系数分别为9.7%和11.5%;检测灵敏度为1∶1280;与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。稳定性试验相对偏差小于25%。结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好，特异性、敏感性强。可用于猪JEV抗体的检测。

乙型脑炎病毒;ELISA

乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)又称日本脑炎，是由黄病毒科(Flaviridea)黄病毒(flavivirus)乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种人畜共患自然疫源性疾病，以中枢神经系统损害为主的急性传染病。猪是本病的主要传染源，能引起怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎。该病在大多数养猪场呈地方性流行，阳性率达20%～30%。人感染后死亡率达30%以上，另外有50%会留下神经系统方面的后遗症，目前还没有人感染JEV后完全治愈的报道［1－2］。

近年来随着生物医学的不断发展，小型猪作为实验动物应用越来越广泛。而乙型脑炎病毒对小型猪也同样会构成严重的威胁，对饲养人员和实验人员也存在着潜在的危险性。为保证小型猪作为实验动物的质量和使用的安全性，有必要对其进行乙脑的检测。我国现行国家标准中没有对实验用小型猪乙型脑炎病毒的检测做出相应的规定。本实验旨在建立灵敏度高、特异性强、操作简便的ELISA方法，对JEV抗体进行检测，为推动了实验用小型猪标准化进程及中国实验用小型猪的质量控制奠定基础［3］。

1 材料和方法

1.1 主要材料

JEV毒种(Nakayama-NIH)、无 JEV抗体牛血清:由本所疫苗一室提供;BHK21细胞:本室冻存;山羊抗猪IgG-HRP:KPL公司产品;猪标准阴、阳对照血清:中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室提供;JEV ELISA检测试剂盒:北京索奥生物技术有限公司和深圳市绿诗缘生物技术有限公司;血清来源:某小型猪饲养场。

1.2 主要仪器

酶标仪:Thermo Multiskan MK3;荧光显微镜:Olypus IX;37℃水浴箱:上海森信实验仪器有限公司DK-4500B型;37℃培养箱:WGP-600。

1.3 方法

1.3.1 病毒感染力滴度(TCID50)测定:将病毒液以10－1～10－11作系列倍比稀释，依次加入培养有BHK21细胞的96孔细胞培养板(costor)(1～11列)，每个稀释度接种1列(8孔)，第12列不加病毒，作为细胞对照。置37℃培养观察10 d，记录结果。

1.3.2 抗原的制备及纯化:正常抗原:BHK21细胞长成单层，常规法消化，PBS洗涤，1 000 r/min离心10 min，沉淀溶于适量PBS冻融3次后，超声破碎，10 000 r/min离心 30 min，取上清液，并测蛋白含量。

特异抗原:收获 JEV细胞毒于4℃，10 000 r/min离心1 h，取上清于4℃，40 000 r/min离心3 h，收集沉淀于适量PBS中。再经20%蔗糖离心后，用紫外分光光度法测定抗原蛋白含量。

1.3.3 判断标准的确定:依据国标选择A490来读取吸光度。在阴、阳对照成立的情况下，待检血清特异抗原孔A值≥0.2、待检血清特异抗原孔A值/阴性对照特异抗原孔A值≥2.1，判为阳性［5］。

1.3.4 正常抗原与特异抗原、酶结合物最佳工作浓度的确定:将阴、阳对照血清和备检血清1∶40稀释［4］。正常抗原分别以 0.05、0.1、0.2、0.4 μg/mL进行包被，特异抗原分别以5、10、20 μg/mL进行包被，羊抗猪 IgG-HRP以 1∶5 000～1∶64 000倍比稀释，通过方阵来确定正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度［5］。

1.3.5 特异性试验:(1)玻片免疫荧光试验:接种JEV的单层BHK21细胞，病变达80%～90%时滴片，同时设正常细胞对照。标准 JEV阴、阳血清1∶10稀释［6］，进行玻片免疫荧光试验。(2)用已建立的ELISA法分别检测猪瘟(CSFV)和猪细小病毒(PPV)、标准阴、阳血清。同时设 JEV标准阴、阳血清对照。

1.3.6 稳定性试验:将4℃放置0、30和90 d的3个不同批次抗原包被板，同时检测已知4份阴性和4份阳性血清，计算 A490变化率(相对偏差)，确定ELISA 法的时间稳定性［8］。

1.3.7 精密性试验:同一份阳性血清的同一稀释度用同一批板同时做 20孔，计算 A490的变异系数［7］。

将4℃放置0、30、60和90 d的4个不同批次抗原包被板，同时检测不同抗体水平的同8份阳性血清和同8份阴性血清，进行批间重复性试验，计算批间变异系数［7］。

1.3.8 灵敏性试验:JEV抗体阳性血清从1:40开始作系列倍比稀释，用建立的ELISA法进行检测，最大稀释比例阳性孔(A490≥0.2)为其检测灵敏度［7］。

1.3.9 可信度:用建立的ELISA方法，对应用商品化ELISA抗体检测试剂盒检测过的已知阴、阳血清60份进行检测，验证此方法的可信度［7］。

2 结果

2.1 病毒感染力滴度

TCID50为 10－10.25/mL。

2.2 BHK21正常抗原蛋白含量为:1.6789 mg/mL;特异抗原JEV蛋白含量为5.3125 mg/mL。

2.3 正常、特异抗原和羊抗猪 IgG-HRP最佳工作浓度分别为 0.2、10 μg/mL 和 1∶20 000。

2.4 特异性实验

(1)免疫荧光试验

JEV阴性血清与病毒感染细胞和正常细胞均无绿色荧光反应;JEV阳性血清与正常细胞无荧光反应，与病毒感染细胞呈强绿色荧光反应(图1和图2，见彩插 3)。

(2)在JEV阴、阳对照均成立的条件下，与猪瘟(CSFV)和猪细小(PPV)病毒阴、阳血清均无特异性反应。

2.5 稳定性

8份血清的 A值变化率(相对偏差)均小于25%。

2.6 精密性

正常、特异抗原批内的变异系数(CV)分别为8.3%和6.4%;正常、特异抗原批间平均变异系数(CV)分别为9.7%和11.5%。

2.7 灵敏度

间接ELISA实验灵敏度测定结果见表1。

表1 间接ELISA实验灵敏度测定结果(A490)Tab.1 The sensitivity of the ELISA detection method

2.8 应用

ELISA方法检测已知阴、阳血清结果见表2。

表2 ELISA方法检测已知阴、阳血清结果Tab.2 Detection results of negative and positive sera with the ELISA technique

46份阴性血清检测出3份阳性，43份阴性，阴性血清检测符合率为93.5%;6份阳性血清检测结果均为阳性，阳性符合率为100%;8份可疑血清中，检测出7份阳性，1份阴性。

3 讨论

本试验用BHK21细胞培养JEV全病毒作抗原，虽经过蔗糖纯化，但也会存在细胞类等非特异性物质，为排除细胞类等物质可能引起的非特异性反应，同时用处理过的BHK21细胞作正常抗原做对照，可以有效排除非特异性反应而造成的假阳性，提高了检测结果的特异性和准确性。

ELISA方法批内变异系数都小于10%，批间平均变异系数都小于15%，说明精密性良好;灵敏度达到1∶1280，说明敏感性很强;免疫荧光试验证明ELISA所用JEV抗原的特异性很强;而且与猪瘟和猪细小病毒均无交叉反应［8］。

本试验开始用建立的检测方法检测已知60份血清，结果显示，抗体阳性率几乎为100%，后用经检测无JEV抗体牛血清配制的稀释液，作为待检血清和酶的稀释液，检测结果为阳性血清16份，阴性血清44份，阳性率为26.7%，与文献报道猪JEV感染率为 20%～30% 相符［1］。

可信度试验中，已知6份阳性血清检测结果均为阳性;8份可疑血清中，有7份阳性，1份阴性;46份阴性血清中，有3份阳性，43份阴性。说明本试验建立的ELISA方法检测敏感性更高。

建议在制定实验用小型猪饲养管理标准方面，希望能对小型猪进行JEV疫苗免疫接种，以保证饲养人员及实验人员的健康与生命安全。而且希望能在今后的工作中，对疫苗接种免疫后小型猪的抗体变化规律进行摸索和研究，为小型猪JEV检测标准的制定提供可靠的数据。

本实验建立的 ELISA方法，具有操作简便、快速、敏感性好、特异性强、检测准确性高等特点［8］，为今后小型猪JEV检测工作和ELISA抗体检测试剂盒的研制及实验用小型猪的质量控制及标准化奠定了基础。

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［4］中华人民共和国国家标准实验动物微生物学检测方法酶联免疫吸附试验［S］.GB/T 14926.50-2001，1－4.

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［6］中华人民共和国国家标准实验动物微生物学检测方法.免疫荧光试验［S］.GB/T 14926.52－200110－12.

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Establishment of an ELISA Technique in Detecting Japanese Encephalitis Virus Antibody

WANG Ji，WEI Li，GONG Wei，GAO Zheng-qin，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biology Products，National Center for Microbiological and Genetic Monitoring of Laboratory Animals，Beijing 100050，China)

Objective To establish an ELISA detection method for Japanese encephalitis virus(JEV)antibody.Methods BHK21cells were cultured and JEV virus was vaccinated.The normal BHK21antigen and JEV-specific antigen were prepared.The optimal working concentration of enzyme conjugate and the normal or specific antigens were titrated，and the accuracy，sensitivity，stability and specificity were tested.Result The best working concentrations of normal and specific antigens and the enzyme conjugate were 0.2 μg/mL，10 μg/mL and 1 ∶20000，respectively.The intra-assay coefficient of variation of normal antigen and special antigen was 8.3%and 6.4%，and the inter-assay average coefficient of variation was 9.7%and 11.5%，respectively.The detection sensitivity was 1∶1280.There was no cross-reactivity with classical swine fever virus(CSFV)and porcine parvovirus(PPV).The stability test showed a relative deviation less than 25%.Conclusion The established ELISA method has good reproductivity，stability，specificity and sensitivity，and can be used in detection of pig JEV antibody.

JEV;ELISA;Detection，method

R-33

1671-7856(2010)08-0056-04

2010-03-16