小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

侯丽波，佟 巍，谢军芳，乔红伟，丛 喆，蒋 虹，王 卫，魏 强

(中国医学科学院 中国协和医科大学医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

侯丽波，佟 巍，谢军芳，乔红伟，丛 喆，蒋 虹，王 卫，魏 强

(中国医学科学院 中国协和医科大学医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的 制备标准化小鼠呼肠孤病毒 III型(reovirus 3，Reo－3)免疫血清，建立小鼠 Reo－3抗体 ELISA检测方法。方法 使用动物来源的Reo－3病毒感染BALB/c小鼠，获得高效价免疫血清;以 BHK－21细胞制备Reo－3病毒抗原，同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo－3血清的最佳工作浓度，进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果 制备18mL抗Reo－3血清，经检测，IFA效价达1∶640，IEA效价达1∶160;Reo－3抗原和标准化小鼠 Reo－3免疫血清最佳工作浓度分别为5 μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系 Reo－3特异抗原批内变异系数为3.8%，批间变异系数为4.0%;检测灵敏度＞1∶4400;与仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、小鼠多瘤病毒(POLY)均无交叉反应。经37℃破坏性试验，2 d稳定性试验相对偏差＜27%。结论 本研究制备的Reo－3抗血清达到同批次大量高滴度的水平，可作为检测实验小鼠Reo－3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好，特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo－3抗体的检测。

呼肠孤病毒Ⅲ;标准化;血清;ELISA

呼肠病毒 III型(Reovirus 3，Reo－3)属于呼肠病毒科的正呼肠病毒属。该病毒能感染所有哺乳动物，在啮齿类动物群体中多呈隐性感染。有报道称该病毒在实验小鼠的8种病毒中占第二位［1］，病毒污染鼠群会干扰肿瘤移植，并且 Reo－3能引起乳鼠的多种系统性疾病，包括坏死性肝炎、心肌炎、胰腺炎以及脑膜炎等疾病［2］。Reo－3在动物群体中通过空气和粪－口途径传播，并且有人认为 Reo－3在环境中能稳定生存是造成病毒污染的主要原因［3］。因而Reo－3是国标要求SPF级实验小鼠必检的项目之一。定期抽样检测是预防和控制鼠群中Reo－3感染的重要手段，本实验旨在制备标准化Reo－3阳性血清并建立ELISA检测方法，解决质控血清小批次不规范等问题，并在此基础上进一步完善ELISA检测方法，丰富同类检测资源。为其他多种病毒血清学方面的标准化监测提供模式，以期在此基础上实现实验动物检测水平的进一步提高。

1 材料和方法

1.1 材料

Reo－3 病毒、BHK－21 细胞，引自 ATCC，本实验室保藏;3日龄SPF级ICR小鼠，6～8周龄，雄性SPF级BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［SCKK(京)2007－0001］。

1.2 主要试剂

羊抗小鼠抗体 protein A－peroxidase，Staphylococcusaureus/horseradish(Sigma公司，P8651);山 羊 抗 小 鼠 FITC－抗 体:fluorescein conjugated IgG fraction goat anti－mouse(Cappel公司，Cat.No.1211－0081);BCA蛋白测定试剂盒(Peirce公司);TMB底物购自济南泰天和生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Reo－3病毒免疫血清的制备:

1.3.1.1 免疫病毒抗原的制备:Reo－3感染 BHK－21细胞CPE达“+++～++++”时，反复冻融3次后，低速除去细胞碎片。取上清液经1∶100稀释后，以脑内注射的方式感染3日龄SPF级ICR乳鼠(带母)，30 μL/只。7～10 d后，无菌操作收取乳鼠内脏，按1∶10(g/mL)重量体积比加入无血清DMEM高糖培养基。充分研磨后，组织悬液离心12 000 r/min，30 min，收取上清液。并取少量感染BHK－21细胞，根据Reed－Muench法测TCID［4］50

1.3.1.2 Reo－3 病毒阳性血清制备:Reo－3 组织毒感染 BALB/c 小鼠，100 TCID50/200 μL/只，分别于0、7、14 d腹腔注射，最后一次免疫后第10天，尾尖采血，56℃ 30 min灭活后测定抗体效价［5］。IFA效价达1∶640，乙醚麻醉后，摘眼球采血。全血静置4 h 后，离心 3 000 r/min，20 min，收集血清。

1.3.1.3 血清效价的初步鉴定［6，7］:取 Reo－3 阳性血清，自1∶10开始，对倍稀释后，用 IFA、IEA法进行效价滴定。同时用本室制备的仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、小鼠多瘤病毒(POLY)进行检测，确定其特异性。

1.3.2 ELISA方法的建立及初步应用比较［8］:

1.3.2.1 Reo－3抗原制备及小鼠质控血清最佳工作浓度的确定:Reo－3感染 BHK－21细胞 CPE达“+++～++++”时，反复冻融3次后，低速离心除去细胞碎片，上清再经超速离心后，收集沉淀于适量PBS中，即为 ELISA抗原。Reo－3抗原用包被液稀释成 10 、7.5、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL 6 个浓度，每个浓度平行包被两孔，制备的Reo－3阳性血清自1∶200开始，对倍梯度稀释。同时做阴性血清和Reo－3阳性血清对正常抗原的对照。HRP－SPA经滴定做 1∶10 000稀释，按常规 ELISA反应，重复 3次［9］。

1.3.2.3 特异性交叉试验:用建立的 ELISA方法在同一条件下对小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、小鼠腺病毒(Mad)、小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)和小鼠多瘤病毒(POLY)等阳性血清进行特异性交叉试验，同时设已知阳性、阴性和空白对照。

1.3.2.4 重复性试验:分别取2块同一批次和不同批次包被的 ELISA板，检测已知阳性 Reo－3小鼠血清，每个样品设3个复孔，在同一批次 ELISA板上进行批内重复，不同批次的ELISA板之间进行批间重复，观察两者差异。

1.3.2.5 敏感性的确定:用建立的ELISA方法，制备的Reo－3血清自1∶200开始作梯度稀释，最大稀释度至1∶4400。按常规ELISA反应，测定本方法的敏感性，重复3次取平均值。

1.3.2.6 稳定性试验:将Reo－3抗原包被的酶标板用封闭液封闭后拍干，按200 μL/孔加酶稳定剂 M，作用5 min后拍干，置37℃进行加速破坏性保存实验［10］。每隔24 h取酶标板，以常规方法进行ELISA测定。每次实验同时取同批次4℃保存的Reo－3抗原包被的酶标板进行实验。

1.3.2.7 初步应用及比较:使用所建立的 ELISA方法对送检小鼠血清进行 Reo－3检测，共计检测30份样本，其中SPF级小鼠血清10份，清洁级小鼠血清10份，背景不确定小鼠血清10份。同时，用本室IEA，IFA检测试剂盒做同等检测，比较检出率。

2 结果

2.1 Reo-3感染BHK-21产生CPE

用 Reo－3 病毒感染 BHK－21 细胞，72 h 后，镜下CPE达“++～++++”。病变细胞形态固缩，成团(图1，见彩插)。

2.2 Reo-3感染BHK-21测定TCID50

Reo－3病毒组织悬液，经 Reed－Muench法测定，TCID50为0.05mL 103.5倍稀释的病毒液，即该病毒3160倍稀释液0.05mL等于一个TCID50。

2.3 IFA、IEA鉴定病毒免疫血清

本实验共收集小鼠 Reo－3阳性血清18mL。经IFA检测，效价达到1∶640，阳性细胞呈绿色荧光着色。IEA检测，效价达到1∶160，阳性细胞呈棕色着色，正常细胞无色(图2，见封三)。Reo－3免疫血清与 SV、MHV、Mad、TMEV和 POLY无特异性反应。

2.4 Reo-3抗原及小鼠标准血清最佳工作浓度的确定

Reo－3 抗原最佳工作浓度为 5 μg/mL;Reo－3 阳性标准血清作1∶2400稀释时，A值在1.0左右，为避免血清存放原因导致抗体滴度下降，将Reo－3阳性标准血清工作浓度定为1∶2000(图3)。

图3 ELISA方阵滴定确定Reo－3抗原最佳工作浓度Fig.3 The optimal effective dose of Reo－3－Ag detected by indirect ELISA

2.5 特异性试验

在Reo－3阴、阳性对照均成立的条件下，与 SV、MHV、Mad、TMEV和POLY阳性血清均无特异性反应。

2.6 敏感性的确定

将所制备的 Reo－3标准化血清(IFA效价 1∶640)自 1∶200 开始稀释，梯度分别为 1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000、1∶2400、1∶2800、1∶3200、1∶3600、1∶4000、1∶4400，按所建立的间接ELISA方法对每个稀释度进行测定，结果显示免疫荧光效价为1∶640的Reo－3标准血清稀释至1∶4400后，其 A值为0.662，仍高于阳性范围，其敏感性比免疫荧光试验要高出6倍以上(表1)。

表1 Reo－3标准化血清间接ELISA效价测定结果Tab.1 Titers of standard Reo－3 sera detected by indirect ELISA

2.7 重复性

经检测，Reo－3特异性抗原批内变异系数(CV)为3.8%;批间变异系数(CV)为4.0%。

2.8 稳定性

将Reo－3标准血清稀释成不同浓度，用同一批次检测体系检测，于37℃放置2 d时A值与0 d A值相对偏差在27%以内。

2.9 初步应用及比对

用本实验室IEA、IFA［11］检测试剂盒和本实验建立的ELISA检测方法同时检测30份送检血清样品，共检出Reo－3阳性样本9例，1例因特异抗原显色与正常抗原对照无显著差异判为可疑(表2)。

表2 IEA、IFA和ELISA法检测血清的结果比较Tab.2 Comparison of detection results by IEA，IFA and ELISA

3 讨论

Reo－3病毒在鼠群中常呈隐性感染，威胁实验动物的健康，进而影响动物实验的可靠性和准确性。因此Reo－3是SPF级大小鼠必检的项目之一。

实验动物微生物感染监测能力和检测技术水平的提升，主要体现在检测诊断试剂的标准化方面。检测用试剂的标准化对检测质量有极大的影响，对检测结果准确性起着决定性作用。怎样使检测方法、技术达到统一、规范和标准化的要求，在保证研究成果的可靠性和科学性方面具有非常重要的意义。在这方面，欧美等发达国家已研制出了系列化、商品化的高质量检测试剂盒。

本研究在本室早期IEA、IFA检测试剂盒研究的基础上，从病毒标准化血清的制备着手，进行Reo－3标准化血清学诊断的研究，为的是进一步优化现有的实验条件，在同一个实验平台建立稳定、可靠的检测体系，为保证实验动物质量做更多的努力。

3.1 Reo-3标准阳性血清的制备

制备标准阳性血清时，用细胞来源的病毒感染动物，制备组织来源的病毒悬液作为抗原。最大程度上消除多价血清中含有抗细胞成分的抗体，避免了IFA、IEA检测中出现正常细胞抗原本底高的现象。由于感染新生乳鼠产生急性症状并死亡，本实验采用CPE达“+++～++++”的细胞培养上清经适当稀释后感染乳鼠，严格监视临床症状，在感染后7 d发现有死亡乳鼠，及时采集小鼠感染脏器，制备组织来源病毒。

本研究制备了18mL Reo－3多价血清。制备血清选用SPF级BALB/c小鼠，并严格按照既定程序进行感染、检测抗体消长和效价。通过IEA，IFA方法检测，该抗血清都能达到效价高(IEA 1∶160;IFA 1∶640)，与多种小鼠病毒无交叉反应，灵敏度高。达到了制备量大，同批次，同条件，高滴度的水平，适于作为标准阳性血清。

3.2 Reo-3 ELISA检测体系的建立和优化

本研究中建立了 Reo－3抗体的 ELISA检测方法，通过特异性交叉试验验证，包被的病毒抗原特异性好，与 SV、MHV、Mad、TMEV 和 POLY 阳性血清均无特异性反应，灵敏度高。通过重复性实验证明，本研究所建立的ELISA检测方法，批内变异系数为3.8%;批间变异系数为4.0%。重复性良好。

在ELISA试剂稳定性检测中，采用37℃度破坏性保存实验。在破坏性保护实验中，37℃放置1 d相当于4℃保存1.5个月［12］。本实验结果显示，所建ELISA检测体系各成分在37℃放置1 d后，与0 d比较，相对偏差为2.9% ～15.9%，而2 d后相对偏差在27%以内，在30%的范围，所以认为所建立的ELISA体系4℃条件下能保持3个月稳定。

检测结果的差异出现在背景不确定小鼠血清上。对出现差异的1份可疑样本，用本实验室成熟的IFA方法对这1例可疑血清进行复检，结果为阳性，与本课题所建ELISA方法检测结果一致。说明本课题所建ELISA方法可用于大批量样品的筛查，对可疑结果可用IFA进行复检。但本实验建立的ELISA试剂盒，需进一步经过条件优化，才能作为ELISA检测试剂盒提供使用。

目前，免疫荧光(IFA)、免疫酶(IEA)、ELISA等均为国际通用的实验动物病毒特异性抗体的检测方法。本研究在建立标准化ELISA检测体系的过程中，用IFA和IEA方法检定病毒的抗血清效价，同时辅助ELISA体系对可疑血清进行复检，从而保证检测结果的可靠性。IFA和IEA检测体系是本实验室建立的成熟的检测平台，在此基础上，本研究再建立稳定灵敏的ELISA方法，实现在同一个实验室对同一种病毒进行不同方法的检测，提高检测结果的可信度和精确性，搭建更为完善的检测平台。

［1］田克恭.实验动物病毒性疾病［M］.北京:农业出版社.1991:83－88.

［2］Uchiyama A，Besselsen DG.Detection of Reovirus type 3 by use of fluorogenic nuclease reverse transcriptase polymerase chain reaction［J］.Lab Anim，2003，37(4):352－359.

［3］Waggie K，Kagiyama N，Allen AM.Manual of microbiologic monitoring of laboratory animals［M］.Bethesda，MD:NIH Publication，1994:99－100.

［4］殷震，刘景华.动物病毒学(第 2版)［M］.北京:科学出版社.1997:329－330.

［5］Murine Virus Diagnostic Laboratory Microbiological Associates.Diagnostic procedures for viral infections of laboratory rodents［M］，Bethesda，Maryland 20016:The Virus Cancer Program National Cancer Institute National Institute of Health Public Health Service，1978:36－40.

［6］中华人民共和国国家标准，实验动物 微生物学检测方法(3)［S］.GB/T 14926.52－2001.

［7］中华人民共和国国家标准，实验动物 微生物学检测方法(3)［S］.GB/T 14926.51－2001.

［8］中华人民共和国国家标准，实验动物 微生物学检测方法(3)［S］.GB/T 14926.50－2001.

［9］John E，Ada M，David H.Current protocols in immunology［M］.Malden，USA，John Wiley and Sons，Inc.2002.

［10］计融，柳桢，江涛，等.总黄曲霉素 ELISA定量检测试剂盒研制［J］.中国公共卫生，2007(3):331－333.

［11］国家药典委员会.中国药典［M］.北京:化学工业出版社，2005:1－9.

［12］涂新明，吴小闲，蒋虹，等.免疫酶染色法(IEA)检测试剂盒的研制［J］. 中国实验动物学杂志，1997，7(3):135－139.

Preparation of Antisera and Establishment of an ELISA Detection Technique for Reovirus III in Laboratory Mice

HOU Li－bo，TONG Wei，XIE Jun－fang，QIAO Hong－wei，CONG Zhe，JIANG Hong，WANG Wei，WEI Qiang
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Comparative Medical Center，Peking union Medical College;Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To prepare a high－titer standard mouse serum against reovirus 3 for quality control of viral infection in laboratory mice and to establish an ELISA method for detecting Reo－3 antibody.Methods BALB/c Mice were infected with Reo－3.Sera were harvested and identified by IFA，IEA.The Reo－3 specific antigen was prepared by raising BHK－21 cells.Results The titers of mouse anti－Reo－3 sera were 1∶640 by IFA and 1∶160 by IEA，respectively.The best working density of Reo－3 antigen and the mouse anti－Reo－3 serum were 5 μg/mL and 1∶2400，respectively.The inter－assay coefficient of variation of normal antigen and specicic antigen was 3.8%.The intra－assay average coefficient of variation was 4.0%.The detection sensitivity was 1∶4400.There was no cross－reactivity with Sendai virus(SV)，mouse hepatitisvirus(MHV)，mouse adenovirus(MAd)，vaccinia virus and mouse polyoma virus(POLY).The stability test showed that the relative deviation was below 27%within 2 days at 37℃ .Conclusion An anti－Reo－3 serum from immunized mice has been prepared.It is with a high titer，sensitive and specific to Reo－3 detection.It can be widely used as a standard control serum to detect Reo－3 serologically.The ELISA method can be used in detecting the Reo－3 antibody in rodent colony with good reproducibility，duplication，stability，specificity，and sensitivity，

Reovirus 3;Standardization;Sera;ELISA;Mouse

R373

A

1671－7856(2010)08－0060－05

2010－1－22

注：A：正常BHK-21细胞形态；B：感染Reo-3的BHK-21细胞固缩，成团。
图1 BHK-21细胞感染Reo-3前后形态比较
Note: A: Normal BHK-21 cells; B: BHK-21 cells infected With Reovirus III.
Fig.1 BHK-21 cells before and after being infected With Reovirus III

注：A：正常 BHK-21细胞涂片（IFA）；B：Reo-3 感染后的 IFA BHK-21 细胞涂片（IFA）（1：640）；C：正常 BHK-21 细胞涂片（IEA）； D：Reo-3 感染后的 IFA BHK-21 细胞涂片（IEA）（1：160）。
图2 使用BHK-21细胞涂片，IFA和IEA方法检定Reo-3多价血清滴度
Note: A， C: Negative control; B: Detected With anti-Reo-3 serum by IFA; D: Detected With anti-Reo-3 serum by IEA.
Fig.2 Titration of the anti-Reo-3 sera from mice by IFA and IEA

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(DWS 200708);科技部条件基础平台专项重点项目(2003DIA7J033);科技部基础专项重点项目(2002DEA20023)。

侯丽波(1978－)，女，硕士生，从事病毒免疫学研究工作。

乔红伟，副研究员，研究方向:实验动物病毒学。E－mail:q_hw2004@yahoo.com.cn