感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心、肾ACE和ACE2的表达

崔慧慧，李 莉 ，杨建一，黄 幸，李 媛 ，张晓玲，武云香

(山西医科大学细胞生物与遗传学教研室，太原 030001)

感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心、肾ACE和ACE2的表达

崔慧慧，李 莉 ，杨建一，黄 幸，李 媛 ，张晓玲，武云香

(山西医科大学细胞生物与遗传学教研室，太原 030001)

目的 研究肾素－血管紧张素系统(RAS)基因血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素转换酶2(ACE2)在感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心肌和肾脏中的表达情况，探讨ACE、ACE2在盐敏感性高血压发生发展中的作用。方法 用乳鼠皮下注射辣椒辣素法建立模型。哺乳期后，大鼠被随机分成4组:对照 +正常盐饮食组 (CON－NS)、对照 +高盐饮食组(CON－HS)、辣椒辣素 +正常盐饮食组(CAP－NS)、辣椒辣素 + 高盐饮食组(CAP－HS)。四组大鼠分别接受4周不同的处理。至7周龄(分组饲养后第4周)处死大鼠，免疫组化检测大鼠心肌和肾脏ACE和ACE2蛋白的表达，反转录－聚合酶链式反应(RT－PCR)检测大鼠心肌和肾脏 ACE和 ACE2 mRNA的表达。结果 ①至7周龄(分组饲养后第4周)各组动物体重差异无显著性(P＞0.05)。②各组动物在分组时(0周)鼠尾收缩压差异无显著性(P=0.583)，至7周龄(分组饲养后第4周)，CAP－HS组鼠尾收缩压明显高于其它三组(P＜0.01)。③心肌和肾脏 ACE蛋白表达均升高。心肌组织，CAP－HS组与 CON－NS比较，P＜0.01，与CON－HS和 CAP－NS比较，P＜0.05;肾脏组织，CAP－HS组与其它三组比较，P＜0.01。④心肌和肾脏 ACE2蛋白表达均降低。心肌和肾脏组织，CAP－HS组与 CON－NS和 CAP－NS比较，P ＜0.01，与 CON－HS比较，P ＜0.05。⑤心肌和肾脏 ACE mRNA表达均升高。心肌组织，CAP－HS组与 CON－NS比较，P＜0.01，与 CON－HS和 CAP－NS比较，P＜0.05;肾脏组织，CAP－HS组与其它三组比较，P＜0.01。⑥心肌和肾脏ACE2 mRNA表达均降低。心肌和肾脏组织，CAP－HS组与 CON－NS和 CAP－NS比较，P＜0.01，与 CON－HS比较，P＜0.05。结论 感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心、肾ACE表达升高的同时有ACE2表达的降低，ACE和ACE2表达水平的差异可能与盐敏感性高血压的形成有关。

盐敏感性高血压;血管紧张素转换酶;血管紧张素转换酶2

盐敏感性高血压指由于相对高盐摄入所引起的血压升高，尽管许多学者和科学家在此领域进行了大量的研究，但仍未完全揭示盐敏感性高血压的细胞及分子机制。除流行病学外，对盐敏感性高血压的研究多采用动物模型进行。本研究通过复制感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠模型，观察肾素－血管紧张素系统(RAS)基因血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素转换酶2(ACE2)在模型大鼠心肌和肾脏表达的差异，探讨其在盐敏感性高血压发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Wistar大鼠，由本校生理学教研室动物室提供并饲养繁殖，合格证号:医动字第070101，动物实验室许可证号:SYXK(晋)2003－0003号。

1.2 主要仪器设备

切片机，YD－202C，浙江金华市益迪医疗设备厂;PCR 扩增仪，Progene Techne;电泳仪，DYY－7C型，北京六一仪器厂;水平电泳槽，JY－SPCT，北京君意东方电泳设备有限公司;台式高速冷冻离心机，Neofuge15R，上海力申科学仪器有限公司;凝胶成像系统，Tanon 2500，天能(上海)科技有限公司;紫外分光光度计，UV－2602型，尤尼柯(上海)仪器有限公司;生物信号显示与处理系统，BL－410，成都泰盟电子有限公司;HX－II小动物血压计。

1.3 药品与试剂

辣椒辣素(CAP)，美国 Sigma公司;苏木素，FMP公司;溴化乙锭(EB)，美国Sigma公司分装;琼脂糖，Solarbio公司;高效切片石蜡，上海华申康复器材有限公司生产;免疫组化试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司生产;RT－PCR试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司生产。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型复制及分组:按参考文献［1］建立模型与分组:新生雄性Wistar大鼠生后第1～2天，实验组皮下注射辣椒辣素50 mg/kg(溶解在含5%乙醇、5%吐温80的生理盐水中);对照组皮下注射同体积的溶液(含5%乙醇、5%吐温80的生理盐水)。哺乳期(3周)后，雄性大鼠被随机分成以下四组:对照 +正常盐饮食组(饲料中含1%NaCl，CON－NS，n=7);对照+高盐饮食组(饲料中含4%NaCl，CON－HS，n=7);辣椒辣素 + 正常盐饮食组(CAP－NS，n=7);辣椒辣素 + 高盐饮食组(CAPHS，n=7)。四组大鼠分别接受以上不同的处理4周。

1.4.2 实验过程 :分组时及分组后各周分别称体重，用尾套法测量大鼠清醒时尾收缩压，测三次取均值。动物7周龄时，即分组后第4周，用20%的乌拉坦以5mL/kg腹腔注射麻醉，速取心脏，生理盐水洗净，滤纸吸干，沿房室沟剪掉两心房及主、肺动脉，紧贴室间隔右侧除去右心室游离壁，剩余为左心室。于心尖部取约100 mg心肌组织，置于冻存管，液氮中保存，准备行 RT－PCR检测;左心室后壁取一份块状心肌组织，以4%甲醛固定，准备行免疫组化检测。取右侧肾脏约100 mg组织，置于冻存管，液氮中保存，准备行 RT－PCR检测;取左侧肾脏组织，以4%甲醛固定，准备行免疫组化检测。

1.4.3 免疫组化检测大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2蛋白表达:操作步骤严格按免疫组化试剂盒说明书进行。用Image－Pro Plus 5.1图像分析软件分析大鼠心肌和肾脏ACE和ACE2的表达水平，以吸光度(A)值表示其相对含量。

1.4.4 反转录－聚合酶链式反应(RT－PCR)检测大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2 mRNA表达:操作步骤严格按试剂盒说明书进行。从 NCBI的 nucleotide中查得目的基因(ACE，transcript ID:NM_012544.1;ACE2，transcript ID:NM_001012006.1)，用 Primer Premier 5.0设计ACE和ACE2上下游引物。以βactin 作为内参［2，3］，进行产物半定量分析，比值表示其相对含量。各对引物序列如表1:

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.5 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件录入实验数据，进行统计分析。实验结果以(±s)表示，用单因素方差分析检验其显著性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重变化

四组实验动物在实验进程中体重均增长，7周龄时(分组后第4周)各组动物体重差异无显著性(P＞0.05)。见表2。

表2 各组大鼠的体重(±s，n=7)Tab.2The body weight of the rats(±s，n=7)

表2 各组大鼠的体重(±s，n=7)Tab.2The body weight of the rats(±s，n=7)

注:各组动物之间体重比较，P＞0.05Note:Comparison of the body weights of the rats in the 4 groups，P＞0.05.

CON－NS 50.25±2.10 190.62±4.10 CON－HS 50.75±2.48 190.51±4.83 CAP－NS 50.99 ±2.90 190.54 ±3.86组别Group 0周体重(g)body weight on 0 week 4周体重(g)body weight on 4thweek CAP－HS 48.84 ±3.00 188.58 ±2.67

2.2 收缩压变化

四组实验动物在分组时(0周)鼠尾收缩压无显著性差异(P=0.583)。在实验进程中收缩压均提高。分组后第1周，CAP－HS组鼠尾收缩压与 CONNS、CAP－NS组比较明显增高(P ＜0.01);分组后第2周，CAP－HS组鼠尾收缩压与 CON－HS组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);大鼠7周龄时，即分组后第4周，CAP－HS组鼠尾收缩压明显高于 CONNS、CON－HS 和 CAP－NS(P ＜0.01)(见表3)。

表3 各组大鼠血压(±s，n=7)Tab.3The blood pressure of rats in the 4 groups(±s，n=7)

表3 各组大鼠血压(±s，n=7)Tab.3The blood pressure of rats in the 4 groups(±s，n=7)

注:**与 CAP－HS组比较，P ＜0.01Note:**Compared with the CAP－HS rats，P ＜0.01

CON－HS 55.57±2.45 107.14±1.95 110.43±1.72** 113.43±1.72** 119.00±3.46**CAP－NS 56.01±1.53 80.86±2.27** 104.71±1.50** 109.00±2.16** 110.00±2.38**CAP－HS 54.54±2.41 107.29±1.80 119.71±3.55 1分组后血压(mmHg)组别Group 0周1周2周3周4周week CON－NS 55.00±1.84 79.71±2.36** 83.00±2.16** 100.57±2.23** 101.00±1.53 0 week 1stweek 2ndweek 3rdweek 4th**32.14±3.13 151.43±4.20

2.3 大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2蛋白表达

心肌组织中，CAP－HS组与其它三组比较，ACE蛋白表达明显升高，有统计学意义，与 CON－NS比较，P ＜0.01，与 CON－HS和 CAP－NS比较，P ＜0.05。其它三组间差异无显著性。肾脏组织中，CAP－HS组与其它三组比较，ACE蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。其它三组间差异无显著性。心肌和肾脏组织中，CAP－HS组与其它三组比较，ACE2蛋白表达明显降低，差异有统计学意义，与 CON－NS 和 CAP－NS 比较，P ＜ 0.01，与 CON－HS比较，P＜0.05。其它三组间差异无显著性。见表4。模型大鼠心肌和肾脏组织中ACE蛋白表达与血压升高呈正相关(相关系数r=0.582，r=0.694，P＜0.01)，ACE2蛋白表达与血压升高呈负相关(相关系数 r=－0.694，r= －0.791，P ＜0.01)。

2.4 大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2 mRNA表达

心肌组织中，CAP－HS组与其它三组比较，ACE mRNA表达明显升高，有统计学差异，与 CON－NS比较，P ＜ 0.01，与 CON－HS 和 CAP－NS 比较，P ＜0.05。其它三组间差异无显著性。在肾脏组织中，CAP－HS组与其它三组比较，ACE mRNA表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。其它三组间差异无显著性(图1)。心肌和肾脏组织中，CAP－HS组与其它三组比较，ACE2 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义，与 CON－NS和 CAP－NS比较，P＜0.01，与 CON－HS比较，P ＜0.05。其它三组间差异无显著性(图2)。见表5。模型大鼠心肌和肾脏组织中ACE mRNA表达与血压升高呈正相关(相关系数 r=0.591，r=0.657，P ＜0.01)，ACE2 mRNA 表达与血压升高呈负相关(相关系数r=－0.666，r=－0.692，P＜0.01)。

表4 各组大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2蛋白表达(±s，n=7)Tab.4ACE and ACE2 protein expression in the heart and kidney of rats in the 4 groups(±s，n=7)

表4 各组大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2蛋白表达(±s，n=7)Tab.4ACE and ACE2 protein expression in the heart and kidney of rats in the 4 groups(±s，n=7)

*:与 CAP－HS组比较，P ＜0.05;**:与 CAP－HS组比较，P ＜0.01Note:*Compared with the CAP－HS rats，P ＜0.05;**Compared with the CAP－HS rats，P ＜ 0.01

组别Group心肌(ACE)heart(ACE)肾脏(ACE)Kidney(ACE)心肌(ACE2)heart(ACE2)肾脏(ACE2)Kidney(ACE2)CON－NS 0.55±0.05** 0.83±0.05** 0.64±0.03** 0.99±0.05**CON－HS 0.57±0.04* 0.85±0.03** 0.61±0.05* 0.89±0.04*CAP－NS 0.56±0.03* 0.82±0.03** 0.62±0.03** 0.92±0.04**CAP－HS 0.62±0.02 0.92±0.02 0.56±0.03 0.83±0.02

表5 各组大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2 mRNA表达(±s，n=7)Tab.5ACE and ACE2 mRNA expression in the heart and kidney of rats in the 4 groups(±s，n=7)

表5 各组大鼠心肌和肾脏ACE、ACE2 mRNA表达(±s，n=7)Tab.5ACE and ACE2 mRNA expression in the heart and kidney of rats in the 4 groups(±s，n=7)

*:与 CAP－HS组比较，P ＜0.05;**:与 CAP－HS组比较，P ＜0.01Note:*Compared with the CAP－HS rats，P ＜0.05;**Compared with the CAP－HS rats，P ＜ 0.01

组别Group心肌(ACE)heart(ACE)肾脏(ACE)Kidney(ACE)心肌(ACE2)heart(ACE2)肾脏(ACE2)Kidney(ACE2)CON－NS 0.18±0.03** 0.28±0.02** 0.24±0.03** 0.35±0.02**.01 CON－HS 0.19±0.04* 0.29±0.03** 0.22±0.02* 0.32±0.02*CAP－NS 0.19±0.03* 0.30±0.05** 0.23±0.02** 0.33±0.03**CAP－HS 0.24±0.02 0.36±0.02 0.19±0.02 0.29±0

图1 各组大鼠心肌(左)和肾脏(右)ACE mRNA表达电泳图Fig.1 ACE mRNA expression in the heart and kidney of rats in the 4 groups

图2 各组大鼠心肌(左)和肾脏(右)ACE2 mRNA表达电泳图Fig.2 ACE2 mRNA expression in the heart and kidney of rats in the 4 groups

3 讨论

RAS是人类及哺乳动物体内一种重要的激素调节系统，对正常的心血管系统发育、电解质和体液平衡、血压调节以及病理状态下心血管系统结构与功能重塑起着重要的作用。从 Yagil等［4］提出RAS调节机体血压的“两臂”学说中我们得知，ACE2与ACE是一对互相拮抗的血管紧张素转换酶(羧肽酶)，这两对物质的相对平衡对维持“稳态”的正常血压起到至关重要的作用，任何一方的含量或活性过高或过低就可能造成高血压或低血压［5，6］。

本研究中应用RT－PCR和免疫组化发现，感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心肌和肾脏组织中存在ACE mRNA和蛋白的高表达，同时也存在ACE2 mRNA和蛋白的低表达。这与Crackower等［7］对自发性高血压大鼠(SHR)、易中风自发性高血压大鼠(SHRSP)和盐敏感型大鼠(SBH/y)肾脏ACE2 mRNA和蛋白的表达研究结果一致。Yagil等［8］通过基因克隆得到了同样的结论。Gurley等［9］和 Yamamoto［10］等学者也有报道。Koka 等［11］观察高血压病人和正常人的心肌发现，在高血压心肌中有 ACE mRNA的高表达，同时存在 ACE2 mRNA的低表达，他们还观察到在人高血压肾病中，存在ACE mRNA和蛋白的高表达和ACE2 mRNA和蛋白的低表达。国内众多学者对SHR、双肾双夹易卒中型肾血管性高血压大鼠的观察结果也都与本研究一致。［2，3，12，13］

由于RAS的过度激活是引起机体整体血压水平升高的病理生理学机制之一，而ACE2的生理学活性与ACE互相拮抗，故感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心脏、肾脏组织中低表达的ACE2可能不足以对抗过度激活的ACE的活性。我们可以推测ACE的高表达和ACE2的低表达在盐敏感性高血压的发生、发展过程中可能发挥了一定的作用。

本研究还发现，在感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠心肌和肾脏中，ACE mRNA和蛋白的高表达与ACE2 mRNA和蛋白的低表达与大鼠血压有一定的相关性，相关性分析表明，ACE的高表达与血压升高呈正相关，而ACE2的低表达与血压升高呈负相关。但也有研究得出相反的结果，在ACE2基因缺陷大鼠模型中［14］，尽管 ACE2敲除后动物在某种遗传特性上与高血压大鼠具有相似性，AngⅡ水平表现出适度的增加，但动物血压和肾组织形态学特性都正常。因此，ACE2是否在机体血压控制中有负性调节作用目前尚不能作出最后结论。还有待于我们进一步的探索和研究。

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Expression of ACE and ACE2 in the Heart and Kidney of Rats with Salt-Sensitive Hypertension Induced by Sensory Denervation

CUI Hui－hui，LI Li，YANG Jian－yi，HUANG Xing，LI Yuan，ZHANG Xiao－ling，WU Yun－xiang
(Department of Cell Biology and Genetics，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To investigate the expression of ACE and ACE2 in the heart and kidney of salt－sensitive hypertensive rats induced by sensory denervation， and to explore their role in the development of salt－sensitive hypertension.Methods Newborn male Wistar rats were given capsaicin subcutaneously to establish the model.After weaning period，they were divided into 4 groups and fed with different salt diets for 4 weeks:control plus normal sodiumdiet(CON－NS)，control plus high sodium diet(CON－HS)，and capsaicin pretreatment plus normal sodium diet(CAPNS)，capsaicin plus high sodium diet(CAP－HS).The rats were killed at 4 weeks after division.Immunohistochemistry was performed to detect the expression of ACE and ACE2 proteins in the heart and kidney.The expression of ACE and ACE2 mRNA in the heart and kidney was determined by reverse transcription polymerase chain reaction.Results ①There was not significant difference in body weight among the 7－week old rats in the 4 groups(4 weeks after grouping)(P ＞0.05). ②The tail－cuff systolic blood pressure was not significantly different in groups before the dietary treatment(P =0.583)，it was significantly higher in the 7－week old CAP－HS rats than that in the other three groups(P ＜0.01). ③The expression of ACE protein in the heart was remarkably higher in the CAP－HS rats，compared with the CON－NS rats(P ＜0.01)and compared with the CON－HS and CAP－NS rats(P ＜ 0.05).It was also significantly increased in the kidney in the CAP－HS rats than that in the other three groups(P ＜0.01). ④The expression of ACE2 protein in the heart and kidney was remarkably decreased in the CAP－HS rats，and with that in the CON－NS and CAP－NS rats(P ＜0.01)，and with that in the CON－HS rats(P ＜ 0.05). ⑤The expression of ACE mRNA in the heart was remarkably higher in the CAP－HS rats compared with that in the CON－NS rats(P ＜0.01)，and with that in the CON－HS and CAP－NS rats(P ＜0.05).It was also highly increased in the kidney in the CAP－HS rats than that in the other three groups(P ＜ 0.01). ⑥ RT－PCR demonstrated that a markedly decreased expression of ACE2 mRNA in the heart and kidney in the CAP－HS rats，compared with that in the CON－NS and CAP－NS rats(P ＜0.01)，compared with that in the CON－HS rats(P ＜0.05).Conclusion The expression of ACE mRNA and protein is increased while the expression of ACE2 mRNA and protein decreased in the heart and kidney of the salt－sensitive hypertensive rats induced by sensory denervation.The different expressions of ACE and ACE2 may be related with the pathogenesis of salt－sensitive hypertension.

Salt－sensitive hypertension;Angiotensin－converting enzyme;Angiotensin－converting enzyme 2;Rats

R－33

A

1671－7856(2010)08－0038－06

2010－03－15

山西省高校科技研究开发项目(20051302);山西省自然科学基金项目(200811076－1)。

崔慧慧(1981－)，硕士生。研究方向:多基因病的分子遗传学。E－mail:chh810729@sina.com。

杨建一，教授。E－mail:jianyiyang@163.com。