五味子对实验性水上漂浮及高强度运动大鼠垂体

五味子对实验性水上漂浮及高强度运动大鼠垂体－性腺轴的影响

2010-09-17孙玲君王扬天胡兰萍

中国比较医学杂志 2010年8期

关键词：五味子睾酮高强度

卢斌，王坚，孙玲君，王群，李洁，王扬天，胡兰萍

(南京军区南京总医院内分泌科，南京 210002)

五味子对实验性水上漂浮及高强度运动大鼠垂体－性腺轴的影响

卢斌，王坚，孙玲君，王群，李洁，王扬天，胡兰萍

(南京军区南京总医院内分泌科，南京 210002)

目的研究五味子对实验性水上漂浮及高强度运动大鼠垂体－性腺轴的影响。方法 34只SD大鼠随机分为非应激对照组(A组，n=10)、应激对照组(B组，n=12)和五味子干预组(C组，n=12)。A组不接受任何刺激，在生理盐水灌胃1周后进行取样。B组和C组进行为期10 d的递增负荷跑台训练，分别用生理盐水和五味子灌胃1周后，行3 h水上漂浮及3 h跑台高强度运动，结束即刻取血，测定血清皮质酮(CORT)、睾酮(T)、黄体生成素(LH);随机取一侧睾丸，HE染色观察组织病理结构;电子显微镜下观察超微结构。结果(1)B组大鼠与A组相比，睾酮水平显著下降;C组大鼠与B组相比，睾酮水平无明显变化，皮质酮水平显著降低;黄体生成素在3组之间均无显著变化。(2)HE染色示3组大鼠睾丸组织病理无明显变化。(3)电子显微镜观察发现，B组大鼠睾丸Leydig细胞线粒体肿胀，电子密度增高;C组大鼠睾丸Leydig细胞线粒体结构趋向于正常，可见分泌颗粒。结论五味子对实验性水上漂浮及高强度运动大鼠睾酮水平无明显作用，对睾丸超微结构有一定保护作用。

五味子;水上漂浮;高强度运动;睾酮;皮质酮;大鼠

应激反应是个体对环境变化所做出的适应，但过度和失衡状态的持续会引起躯体功能的紊乱和疾病的发生。有关应激反应发生机制及其调节因素的研究受到广泛关注，其中中草药对机体应激反应的调节成为相关研究的重点。本研究通过五味子对实验性水上漂浮和高强度运动大鼠的干预，观察大鼠性激素水平的变化，睾丸组织病理学改变，探讨五味子对应激大鼠下丘脑－垂体－性腺(HPG)轴的调节作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

五味子购自南京金陵大药房，粉碎后置于清水中浸泡20 min，加热至沸腾，回流30 min，过滤并浓缩，使其质量浓度相当于原药1g/mL。T、LH、CORT放射免疫分析药盒购自北京市福瑞生物工程公司。

1.2 实验动物与分组

清洁级雄性SD大鼠，鼠龄6周，体重120～150 g，共24只，由南京军区南京总医院比较医学科提供。动物合格证号:SCXK－(军)2007－0102。试验前在清洁级动物饲养中心以标准啮齿类动物维持期饲料适应性饲养1周，自由进食和饮水，室内温度为(20～24)℃，湿度50%～70%，12 h光照与12 h暗夜交替。大鼠随机分为3组:非应激对照组(A组，n=10)、应激对照组(B组，n=12)和五味子干预组(C组，n=12)。实验过程中 A组不接触任何应激源，B组、C组大鼠的笼子每天晚上8点开始与土猫的笼子并排放置，使大鼠从视觉、听觉和嗅觉上受到土猫的刺激，大鼠和土猫之间无直接接触，每天12 h，共10 d，造成慢性心理应激模式。各组大鼠均自由饮食饮水。C组按照2.25 g/kg体重，每天2次，用五味子水煎液灌胃;A组、B组用同体积的生理盐水灌胃，灌胃共1周。

1.3 实验过程

B组、C组大鼠参照 Bedford［1］跑台训练方法进行为期10 d的训练，首先两组大鼠进行3 d适应性训练，跑台坡度0°，速度15 m/min，每天训练历时15 min，之后隔天训练 1次，跑速逐渐增加 26.8 m/min，训练时间逐渐增加至60 min，最后两次坡度由0°改为5°，总共训练10 d。适应性训练3 d后，C组按照2.25 g/kg体重，每天2次，用五味子水煎液灌胃;A组、B组用同体积的生理盐水灌胃，灌胃共1周。实验第11天晨8点将B组、C组大鼠置于木制船模型(1.4×0.8×0.4)m，由泰兴市竹泓县庆雷木船厂定制)中。船模型漂浮于长方体的充气水池内，水池右侧有一根据造浪球原理设计的电动机械造浪装置，使船前后左右摇摆±20°。大鼠在水上漂浮历时3 h，期间禁食水。结束后两组大鼠立即进行跑台高强度运动，期间继续禁食水。按照 Bedford等运动强度与最大耗氧量关系的研究，大鼠运动强度定为:坡度为5°，速度为26.8 m/min。历时3 h。若跑台运动时大鼠提前出现力竭症状，即不能坚持负荷跑速，滞留跑道后1/3处达3次以上，刺激驱赶无效，则提前处死。

1.4 取材

实验结束，采用氯胺酮(10 mg/100 g)腹腔麻醉，沿腹正中线剪开腹壁，横膈，暴露心脏，细针穿刺心脏静脉窦取血5mL，置于加有40 μL抑肽酶的离心管内，室温下2 500 r/min离心20 min，制备血清，－20℃保存，用于测定 CORT、T、LH水平。分离睾丸，用蒸馏水冲洗睾丸3次后取新鲜组织约1mm3，置于2.5%戊二醛固定并放置4℃冰箱冷藏，剩余睾丸组织置于甲醛固定液中。

1.5 血清激素测定与睾丸超微结构观察

用放射免疫方法检测大鼠血清T、LH、CORT水平，检测方法参照试剂盒说明。取出4℃中性缓冲甲醛固定好的睾丸，取材，石蜡包埋，常规切片，切片厚度4 μm，HE染色，光学显微镜下观察睾丸结构。取出2.5%戊二醛固定好的睾丸组织，用1%锇酸固定液固定，丙酮梯度脱水，Epon812环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀－柠檬酸铅双重电子染色，JEM－1000型透射电镜观察并摄取图像。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠血清LH、CORT、T水平的变化

与A组相比，B组大鼠血清T浓度显著降低(P＜0.01)，CORT水平明显升高的趋势但未达到统计学意义(P＞0.05);与B组相比，C组CORT浓度显著降低(P＜0.05)，T水平稍微增加(P＞0.05);LH在3组中均无显著变化。见表1。

表1 各组大鼠血清 LH、CORT、T水平的变化Tab.1 Comparison of the levels of serum LH，CORT and T among the 3 groups

2.2 各组大鼠睾丸HE染色改变

A组、B组和C组大鼠睾丸HE染色中均见曲细精管致密，基膜完好，支持细胞和各级生精细胞正常，间质细胞胞浆丰富，嗜酸性。各组睾丸组织形态学未见明显差异(图1，见彩插 2)。

2.3 各组大鼠睾丸的电镜改变

A组大鼠睾丸Leydig细胞线粒体结构清晰，基质电子密度高，嵴呈管状交错排列，胞质中见溶酶体，可见大小不等的圆形或卵圆形深染分泌颗粒。B组大鼠睾丸间质细胞见线粒体肿胀，电子密度增高，嵴减少或消失。C组大鼠睾丸间质细胞见线粒体结构趋向于正常，可见200～400 nm左右大小不等深染的分泌颗粒(图2)。

图2 三组大鼠睾丸超微结构的变化 (A:对照组;B:应激组;C:五味子组)(为溶酶体，为线粒体)Fig.2 The ultrastructure of the testis cells in the rats of each group.A:Control group;B:Stress control group;C:Schisandra administration group.(lysosome， mitochondrion)

3 讨论

应激是指机体在各种内外环境因素刺激下所出现的全身性非特异性反应，但过度和失衡状态的持续会引起躯体功能的紊乱和疾病的发生。愈来愈多的证据表明，在目前严重影响人类健康的疾病中，多数与应激因素的长期作用密不可分。应激的机制广泛而复杂，主要是通过交感神经－肾上腺髓质轴和下丘脑－腺垂体－靶腺轴进行调节。其中下丘脑－垂体－性腺轴是参与应激反应的重要组成部分，也是容易受到应激危害的系统。负性心理因素及高强度运动会造成机体的过度应激，抑制下丘脑－垂体－睾丸轴(HPG)功能［2］，而 HPG轴功能下降是造成运动能力下降的重要因素。

本实验发现实验性水上漂浮及高强度运动大鼠与非应激对照组相比，血清睾酮水平显著下降。虽然HE染色未见睾丸形态明显改变，但电镜结果显示睾丸Leydig细胞线粒体水肿，呈分泌功能减退的形态学改变。大量研究表明严重心理应激如恐惧、精神压力、情绪低落等引起的心理应激均会使血睾酮水平显著降低［3］。运动对睾酮水平的影响与运动的密度、负荷强度、负荷持续时间等因素有关［4－5］。长时间大强度运动会引起睾酮水平明显降低。其可能机制主要有:外周组织尤其是肌肉组织对睾酮的消耗增加，睾丸自身调节功能变化和机体HPG轴受抑制。本研究中应激大鼠睾酮水平下降，而LH水平未见明显变化，可能的原因是大运动量训练可造成LH对GnRH的应答能力受抑，使LH不能在低血清T时出现反馈性增加。低血清睾酮可能是由于训练导致大鼠在力竭运动时更完全动用睾酮储备，也和应激引起LH受体表达的变化有关［6］。有学者认为应激引起 HPG受抑制与应激导致下丘脑－垂体－肾上腺(HPA)轴激活密切相关［7］。长时间剧烈运动后，由于下丘脑分泌CRH增加，并作用于腺垂体，引起腺垂体释放ACTH，使肾上腺皮质分泌肾上腺皮质激素量增多，肾上腺皮质激素持续增加抑制多种激素分泌，其中包括抑制性激素的合成，而且还诱导leydig细胞凋亡，导致睾酮水平下降［8］。本研究发现应激组大鼠CORT明显高于非应激对照组，提示高CORT是导致睾酮水平下降的重要原因。

许多实验所证实力竭运动可引起氧化应激，使机体产生的自由基增多，自由基的异常增多引起细胞及亚细胞器如线粒体损伤，造成细胞功能下降，进而影响运动能力。五味子具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心等功效，对自由基引起的损伤有明显的保护作用。本课题组孙玲君等研究发现五味子可降低应激大鼠CORT水平，并在一定程度上保护肾上腺皮质细胞结构［9］。本实验中，灌服五味子大鼠CORT水平明显低于应激组(P＜0.05)，使之趋于正常，说明五味子有调节 HPA功能，防治应激损伤。与应激组相比，五味子干预组仅能部分提高T的水平(P＞0.05)，但干预组大鼠睾丸间质细胞中见线粒体结构趋向于正常，并可见较多大小不等的分泌颗粒，表明五味子可以保护应激大鼠睾丸的超微结构。这与五味子抑制增高的皮质酮水平，从而减少对睾丸的影响密切相关。五味子如何改善睾丸超微结构机制还不清楚。五味子含有多种活性成分，不同剂量有不同作用，这可能是本研究中五味子未能有效防止应激造成的低睾酮血症的原因，有待下一步通过不同剂量五味子进行实验以明确。

综上所述，五味子能保护显著降低应激大鼠CORT水平，保护应激大鼠睾丸的超微结构，提示五味子可在某一方面改善心理应激和运动应激所造成的内分泌系统的紊乱，增强大鼠的抗应激能力。

［1］Bedford TG，Tipton CM，Wilson NC，et a1.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures［J］.J Appl Physiol，1979，47(6):1278－1283.

［2］李洁，王坚，赵旦，等.实验性水上漂浮和高强度运动对大鼠下丘脑－垂体－睾丸轴功能的影响［J］.中华男科学杂志，2008，14(1):58－61.

［3］Hickson RC，Hidaka K，Foster C，et al.Successive time courses of strength development and steroid hormone responses to heavyresistance training［J］.J Appl Physiol，1994，76:663－670.

［4］Kokalas N，Tsalis G，Tsigilis N，et a1.Hormonal responses to three training protocols in rowing［J］.Eur J Appl Physiol，2004，92(1):128－132.

［5］Raastad T，Bjoro T，Hallen J.Hormonal responses to high－and moderate－intensity strength exercise［J］.Eur J Appl Physiol，2000，82(1):121－128.

［6］Kraemer WJ，Ratamess NA.Hormonal responses and adaptations to resistance exercise and training［J］.Sports Med，2005，35(4):339－361.

［7］Wheeler G，Cumming D，Burnham R，et a1.Testosterone，cortisol and catecholamine responsesto exercise stress and autonomic dysreflexia in elite quadriplegie athletes［J］.Paraplegia，1994，32(5):292－299.

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［9］孙玲君，王国洪，吴波，等.五味子对实验性慢性心理应激下水上漂浮并高强度运动大鼠垂体－肾上腺皮质、性腺轴功能及糖代谢的影响［J］.中华男科学杂志，2009，15(2):126－129.

Effects of Schisandra on the Function of the Pituitary-Gonadal Axis of Rats Undergoing Negative Psychological Stress Induced by Experimental Navigation and Intensive Exercise

LU Bin，WANG Jian，SUN Lin－jun，WANG Qun，LI Jie，WANG Yang－tian，HU Lan－ping
(Department of Endocrinology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region，Nanjing 210002，China)

Objective To study the effects of schisandra on the function and ultrastructure of the pituitary－gonadal axis in rats undergoing experimental navigation and intensive exercise.Methods Thirty－four male SD rats were randomized into three groups:non－stress group(Group A)，stress control group(Group B)，and schisandra administration group(Group C).Blood samples were collected from the group A after a 7－day intragastric administration of saline.Group B

7－day intragastric administration of saline，underwent intensive exercise for 10 days.The rats of group C were subjected to the same process of running training as the B group and received intragastric administration of schisandra.Blood samples were obtained to determine the levels of testosterone(T)，corticosterone(CORT)，and luteinizing hormone(LH).The testes were excised for HE staining and electron microscopy.Results Compared with the group A，the level of testosterone was significantly decreased in the group B(P＜0.01).Compared with the group B，the CORT level was decreased(P＜0.05)and T level was not changed in the group C.For the level of LH，there were no significant differences among three groups(P＞0.05).HE staining revealed no significant difference in the histopathology of testisamong the three groups.Ultrastructural observation showed that the number of granules in the Leydig cells in the testes significantly increased in the group C compared with that in the group B，and the Leydig cells showed mitochondrial swelling，decreased/disappearance of the mitochondrial cristae and increased cell electron density in the group B，but somehow returning to normal appearance in the group C.Conclusion Schisandra can reduce the CORT level，but has little effect on T level.Schisandra may ameliorate the ultrastructural changes of testis in rats with stress.

Schisandra;Navigation;Intensive Exercise;Testosterone;Corticosterone;Rat

R332

1671－7856(2010)08－0026－04

2010－03－15