D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备

李慧，张巍，申明霞，李伟国，刘艳丽，刘素芳，祁超

1 华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，武汉 430079 2 华中师范大学化学学院 农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉 430079

D1蛋白酶的克隆表达、纯化、生物活性测定及多克隆抗体的制备

李慧1*，张巍1*，申明霞1，李伟国2，刘艳丽1，刘素芳2，祁超1

1 华中师范大学生命科学学院 遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，武汉 430079 2 华中师范大学化学学院 农药与化学生物学教育部重点实验室，武汉 430079

为了开发以D1蛋白酶作为靶标的新型除草剂，需要对先导化合物的生物活性进行检测和筛选。从菠菜中提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用PCR扩增了CtpA的基因，连接至表达载体pET-28a中，构建了重组表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达，通过降低IPTG和诱导温度获得了可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤柱层析对重组蛋白进行了纯化，SDS-PAGE和Western blotting结果证实目的蛋白为含有His-tag的融合蛋白。以合成的D1前体蛋白羧基端24肽作为模拟底物，采用高效液相色谱法测定了其水解活性，结果表明活性可达1.10 nmol/(mg·min)，为文献报道数据的15倍。纯化后的CtpA蛋白免疫日本的长耳大白兔制备多克隆抗体，ELISA法测定其血清抗体的效价高达1：100 000。该结果为抑制剂先导化合物的筛选和酶蛋白与化合物的作用机理研究提供了必要的基础。

D1蛋白酶，表达，纯化，生物活性，多克隆抗体

Abstract:Carboxyl-terminal processing protease of D1 protein(CtpA)catalyzes carboxyl terminal processing of the D1 protein of photosystem II, which is essential for the assembly of a manganese cluster and consequent light-mediated water oxidation.It is a target for the discovery of wide-spectrum herbicide.We amplified the CtpA gene from spinach cDNA with standard PCR methodand constructed it into pET-28a vector to generate a recombinant expression plasmid.Recombinant CtpA fusion protein with His-tag was expressed as soluble protein inEscherichia coliBL21(DE3)after induction with 0.1 mmol/L IPTG at 8°C for 72 h.We purified the CtpA protein with the Ni-NTA affinity chromatography and Superdex 75 gel filtration chromatography respectively, and verified the protein by SDS-PAGE and Western blotting with anti-his antibody.Hydrolysis activity of CtpA was assayed by HPLC method with a synthetic 24-mer oligopeptide corresponding to carboxyl terminal of precursor D1 protein, and gave a total activity of 1.10 nmol/(mg·min).We used the purified CtpA protein as antigen to immune rabbit for the production of polyclonal antibody, and prepared antibody with high specificity and sensitivity.The results obtained in this paper provided the feasibility of high-throughput screening of lead compounds for the protease as inhibitors and mechanism analysis of CtpA enzyme.

Keywords:carboxyl-terminal processing protease(CtpA), expression, purification, activity, polyclonal antibody

农药对于保证农业实现稳产增收具有重要意义，自20世纪40年代发展选择性植物激素类除草剂以来，经典的盆栽技术与喷洒筛选方法已经获得了270个品种、17种作用模式的除草剂。但是近年来，随着植物对农药抗性的增加，以及社会和环境对农药品种安全性的要求，许多农药品种已经被列入禁用名单，实际上在市场上使用的农药品种在相对地减少。因此，开发高效、低毒、环境友好的新型农药显得尤为迫切[1]。

D1蛋白是植物光合系统II中的一个组成亚基，起着连接电子供体和放氧复合体的作用，它是由质体psbA基因编码的大小约40 kDa的膜蛋白，在植物类囊体中以前体蛋白(pD1)的形式表达，需要在D1蛋白酶(Carboxyl-terminal processing protease，CtpA)的作用下剪切掉其羧基端延伸的肽段之后成为成熟的 D1蛋白(mD1)。D1蛋白酶是由叶绿体核ctpA基因编码的含有389个氨基酸残基的单亚基蛋白，大小约为45 kDa，主要酶切D1前体蛋白中C端延伸的肽段，使之转变为mD1[2-3]，进一步用于光合系统II中锰簇合物的组装，具有维持光合系统II损伤-修复循环过程的重要作用[4]，该酶切过程是植物进行光合作用必不可少的步骤。集胞蓝细菌Synechocystis sp和斜生栅藻Scenedesmus obliquus在ctpA基因敲除后均呈现出非光合自养的表型[5-7]，证实 D1蛋白酶也是植物光合作用链中的重要组成部分，因此D1蛋白酶被认为是一个新型优异的广谱除草剂作用靶标[8]。由于D1蛋白酶在植物中的含量只有 D1蛋白的 1%左右，与当前广泛使用的以抑制D1蛋白为靶标的除草剂(如西玛津、阿拉特津、敌草隆等)相比，开发以D1蛋白酶作为靶标的除草剂将会使得农药的施用量大幅度减少，对环境和人类的毒副作用也将会大为降低，可望成为新一代的农药品种。

本研究根据开发新型农药品种的实际需要，利用基因工程方法将 CtpA基因定向克隆至原核表达载体 pET-28a中，并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，实现了D1蛋白酶的可溶性融合表达，采用 Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白酶进行了纯化并测定了其生物活性，同时用纯化的蛋白制备多克隆抗体，为D1蛋白酶抑制剂先导化合物的筛选和蛋白酶与化合物的作用机理研究提供了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒 pET-28a和大肠杆菌 DH5α、BL21(DE3)均为本实验室保存。pMD 18-T Vector、DNA限制性内切酶Nhe I和Xho I、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、M-MLV TRase cDNA Synthesis Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit、DNA Marker和低分子量蛋白Marker均购自大连TaKaRa生物工程有限公司。酵母提取物(Yeast extract)和胰化蛋白胨(Tryptone)购自Oxoid公司。氨苄青霉素(Amp)、卡那青霉素(Kana)、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、二硫苏糖醇(DTT)、三氟乙酸(TFA)、弗氏完全及不完全佐剂均购自Sigma公司。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购自Amresco公司。乙腈(色谱纯)购自 Tedia公司。Ni-NTA亲和柱、HiLoad 16/60 Superdex 75、ÄKTA purifier 100蛋白纯化系统为GEHealthcare公司产品。Anti-His antibody购自天根生化科技有限公司。BCA Protein Assay Kit为美国Pierce公司产品。PCR引物及重组质粒测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。Hypersil BDS C8(5 μm，0.46 cm × 15 cm)反相柱购自大连依利特分析仪器有限公司。9肽(AIEAPSTNG)和 24肽(VMHERNAHNFPLDLA↓AIE APSTNG，其中↓为酶切位点)均由上海吉尔生化有限公司采用固相合成法合成，并经过高效液相色谱和质谱测定确认。其余试剂均为国产分析纯。试验动物日本长耳兔2只，体重1.5～2.0 kg，购于湖北省疾病预防控制中心下属的实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 菠菜总RNA的提取和cDNA的合成

参照植物RNA的提取方法，采用TRIzol法从菠菜中提取总RNA，得到白色的RNA沉淀，用DEPC水溶解。取5 μL提取的总RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳检测。按照TaKaRa公司提供的cDNA合成试剂盒说明，先合成 cDNA第一链，再合成cDNA第二链，最后对合成的cDNA进行精制，取5 μL合成的 cDNA经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后−20℃保存。

1.2.2 PCR引物设计、合成与PCR扩增

根据 GenBank中获得的 CtpA 基因序列(Accession No.D50585)，设计了一对引物，序列如下：CtpA-1：5′-GAGAGCTAGC CTTTCTGAGGAGA ATCGA-3′，其中下划线部分为限制性内切酶 Nhe I的识别序列；CtpA-2：5′-GTGTCTCGAGTCTTGAGA AAAGAGTTGTAC-3′，其中下划线部分为限制性内切酶Xho I的识别序列。以合成的cDNA为模板，CtpA-1、CtpA-2为引物，扩增CtpA目的基因。扩增条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。取样进行琼脂糖凝胶电泳分析，采用胶回收试剂盒回收目的基因。

1.2.3 克隆载体pMD18-T-CtpA的构建及序列测定

按照pMD18-T Vector试剂盒说明书要求，取2 μL回收后的CtpA基因与1 μL pMD18-T载体连接，并转化至大肠杆菌 DH5α中，通过蓝白斑筛选，挑选白色菌落扩大培养后，采用限制性内切酶 Nhe I和 Xho I酶切重组质粒 pMD18-T-CtpA，同时进行PCR扩增鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳分析。将鉴定结果正确的阳性菌和质粒送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.2.4 表达载体pET-28a-CtpA的构建及鉴定

用限制性内切酶Nhe I和Xho I将CtpA基因从重组质粒 pMD18-T-CtpA上切下，再用同样的限制性内切酶酶切质粒pET-28a，将CtpA片段和pET-28a酶切产物用 1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收后，分别取4 μL CtpA基因与2 μL载体 pET-28a，用约1 μL T4 DNA连接酶(350 U/μL)于16℃连接过夜，连接后的产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，接种于含50 mg/mL卡那霉素的LB平板上培养，次日挑取单克隆菌扩大培养后，采用碱裂解法提取质粒DNA，用限制性内切酶Nhe I和Xho I酶切重组质粒pET-28a-CtpA，同时以该质粒为模板，合成的CtpA-1和CtpA-2为引物进行PCR扩增，酶切和PCR扩增后的产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

1.2.5 CtpA的诱导表达及纯化

从卡那平板上挑取经酶切和PCR鉴定正确的单菌落，接种于10 mL含有50 mg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、250 r/min继续振荡培养至A600为0.8左右，吸取2 mL培养物作为未诱导的样品，在剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，继续培养 4 h，离心收集菌体，超声波破碎后采用SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况。

为了大量表达和纯化蛋白酶，挑取单菌落接种于30 mL含有卡那霉素的LB培养基中，37℃、250 r/min振荡培养过夜，次日按照1∶100的比例接种于400 mL新配的LB培养基中，37℃、250 r/min继续振荡培养至A600为0.8左右，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，然后在8℃、250 r/min继续振荡培养72 h。诱导后的菌液在4℃、8000 r/min 离心20 min，收集菌体。按照每克湿菌体加入10 mL柱平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl)的量充分悬浮菌体，在冰浴条件下超声破碎菌体(300 W，工作5 s，间歇3 s，共99次)，然后4℃、12 000 r/min 离心40 min，分离上清液和沉淀。将上清液加至预先用平衡缓冲液充分平衡好的Ni-NTA亲和层析柱(1 mL)，并用平衡缓冲液淋洗10个柱体积，然后换用含不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱 CtpA蛋白，收集各组分，并将各组分进行12% SDS-PAGE电泳分析。采用超滤法(Millipore，截留分子量 3000)对纯化后的蛋白进行浓缩，浓缩后的样品采用Superdex 75凝胶过滤层析柱(HiLoad 16/60，GE)进一步纯化，采用缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150 mmol/L NaCl)洗脱，流速为1.0 mL/min，通过280 nm处的光吸收进行检测，收集各组分，12% SDS-PAGE电泳分析。蛋白浓度采用BCA法测定。

1.2.6 表达产物的Western印迹分析

蛋白Western 印迹分析参照GE Healthcare Life Sciences全湿电转印系统TE22操作手册进行。将浓缩的蛋白经12% SDS-PAGE 分离后，400 mA电流强度水浴10℃将CtpA融合蛋白从凝胶上转移至硝酸纤维素膜后，以含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液4℃封闭过夜，1×PBS、0.1%吐温 20洗涤 3次，然后与anti-His抗体37℃反应1 h，用1×PBS、0.1%吐温20洗涤2次，每次1 h，再与1:20 000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体在 37℃温育 1 h，1×PBS、0.1%吐温20洗涤2次，每次1 h。最后以沉淀型单组分TMB底物溶液显色。

1.2.7 D1蛋白酶的活性测定

纯化后的D1蛋白酶活性测定以合成的D1蛋白前体羧基端24 肽作为模拟底物，采用 1100高效液相色谱检测系统(Aglient)和Hypersil BDS C8(5 μm，0.46 cm×15 cm)反相柱对水解产物进行分离和检测[9]。取 21 μL D1 蛋白酶(0.657 mg/mL)和3 μL底物P-24(5 mmol/L)加入至1.5 mL EP管中，并用缓冲液(50 mmol/L HEPES，pH 7.7，100 mmol/L NaCl，100 ml/L甘油，0.5 g/L曲拉通X-100)补足至 73 μL，25℃恒温反应 6 h后加入 27 μL TFA(0.1 mol/L)中止反应。10 000 r/min离心10 min，取20 μL上清液进行高效液相色谱测定。色谱分离条件：以水(含 0.1%TFA)为洗脱水相，乙腈(含0.065%TFA)为洗脱有机相，0～1.00 min用10%有机相平衡反相柱，1.01～16.00 min采用有机相进行体线性梯度(10%～40%)洗脱，检测波长为220 nm。

1.2.8 重组CtpA血清多克隆抗体的制备和鉴定

免疫前，从耳缘静脉少量取血，用作阴性对照。取1.3 mg重组CtpA蛋白与2 mL弗氏完全佐剂混合成油包水的乳剂，免疫日本长耳大白兔。14 d后取1 mg 重组蛋白与2 mL弗氏不完全佐剂混合成油包水的乳剂加强免疫，每两周1 次。第3 次加强免疫后，从耳缘静脉少量取血，ELISA检测血清效价。效价合格后，颈动脉放血，4℃放置过夜，收集血清，分装冻存。

2 结果

2.1 菠菜总RNA的提取和cDNA的合成

采用TRIzol法提取得到菠菜的总RNA后，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1A所示。在电泳图中显示出明显的28S rRNA和18S rRNA条带，无拖尾，且28S rRNA与18S rRNA亮度比接近2∶1的比例，说明总 RNA的完整性良好，可用于cDNA的合成。以总RNA为模板，经逆转录酶催化合成cDNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图1B所示。电泳图中显示cDNA亮度良好，约为Marker的3倍，可用于目的基因的PCR扩增。

2.2 PCR扩增CtpA目的基因

以合成的cDNA为模板，设计的短链DNA为引物，经过PCR扩增后的产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，PCR扩增后的产物大小约为1200 bp，与CtpA基因的理论编码序列大小相符合。

图1 菠菜总RNA的变性琼脂糖凝胶电泳(A)和cDNA的琼脂糖凝胶电泳(B)Fig.1 Agarose gel electrophoresis of spinach total RNA(A)and spinach cDNA(B).(A)1−3: RNA.(B)1, 2: cDNA;3: 10 000 bp ladder DNA marker.

图2 CtpA目的基因的PCR扩增Fig.2 PCR amplification ofCtpAgene encoding region.1:PCR product; 2: 100 bp ladder DNA marker.

2.3 重组质粒pET-28a-CtpA的构建和鉴定

为了便于构建重组质粒，将回收后的PCR产物先与pMD18-T载体连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过蓝白斑筛选得到含有目的基因的阳性菌。采用限制性内切酶Nhe I和Xho I酶切克隆载体pMD18-T-CtpA，得到目的基因片段，然后与同样经过Nhe I和Xho I酶切后的表达载体pET-28a连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单菌落提取质粒，采用Nhe I和Xho I进行双酶切进行鉴定，同时以此质粒为模板，采用PCR扩增进行鉴定，所得结果如图3所示。由1%琼脂糖凝胶电泳图中可以看出，以重组后的质粒为模板可以扩增出约1200 bp的产物，酶切后的质粒在相同位置也出现大小一致的片段，说明目的基因片段与表达载体连接正确，表达载体 pET-28a-CtpA的构建是成功的。DNA序列测定结果证实：扩增序列与菠菜的D1蛋白酶DNA序列一致。

图3 表达载体pET-28a-CtpA的PCR和双酶切鉴定Fig.3 Identification of pET-28a-CtpA by PCR and enzyme digestion.M: 100 bp ladder DNA marker; 1: PCR product of pET-28a-CtpA; 2: pET-28a-CtpA digested withNheI andXhoI.

2.4 重组CtpA蛋白的表达与纯化

重组质粒 pET-28a-CtpA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，在37℃条件下经0.4 mmol/L IPTG诱导4 h后，与对照菌相比，在45 kDa位置出现了一条明显的显色带，结果如4A所示。由图中可以看出，诱导表达的重组质粒主要以包涵体的形式表达，以可溶性形式表达的重组蛋白较少。而未诱导的质粒在相同位置也有表达，但目的蛋白的表达量，特别是包涵体的表达量要明显少于诱导表达质粒。诱导表达获得了高表达量的目的蛋白，但为了获得可溶性表达的目的蛋白，比较了IPTG浓度以及诱导温度对CtpA蛋白高效可溶性表达的影响，发现降低诱导剂IPTG的用量以及降低诱导温度后，包涵体形式的目的蛋白明显减少，而亲和层析结果表明可溶性形式的目的蛋白逐渐增多，尤其是降低诱导温度后，对改善蛋白酶的可溶性表达效果更为明显(图4B)，经过优化后确定的IPTG用量为0.1 mmol/L，最佳的诱导温度为8℃。

为了纯化可溶性表达的重组蛋白，将阳性单菌落接种于含有卡那霉素的LB培养基中，8℃、250 r/min条件下诱导培养72 h。获得的菌体超声破碎，上清液通过 Ni-NTA亲和层析柱纯化，并用含不同浓度咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，所得结果如图5所示。从电泳图中可以看出经过8℃诱导表达72 h后的菌液，上清中的目的蛋白明显增多，表达后的蛋白与亲和柱的结合较牢固，在咪唑浓度为150 mmol/L后才得以被洗脱，合并洗脱后的目的蛋白，再经过Superdex 75 凝胶过滤柱层析进一步纯化，用BandScan5.0软件分析，计算得到的重组蛋白酶纯度达到94.9%(泳道7)。BCA法测定结果表明重组蛋白的表达量约为5～6 mg/L。采用anti-His 抗体进行Western blotting印迹分析证实纯化后的蛋白为带有His-tag的融合蛋白(泳道10)。

2.5 重组CtpA的生物活性测定

图4 重组质粒的表达(37℃)(A)和不同温度对蛋白表达的影响(B)Fig.4 Expression of recombinant CtpA at 37°C(A)and effect of induction temperature on the expression of CtpA(B).(A)1:protein marker; 2: induced supernatant; 3: induced precipitate; 4: controlled supernatant; 5: controlled precipitate.(B)1: protein marker; 2: induced supernatant at 16°C; 3: induced precipitate at 16°C; 4: induced supernatant at 37°C; 5: induced precipitate at 37°C;6: induced supernatant at 8°C; 7: induced precipitate at 8°C.

图5 采用 Ni-NTA亲和层析柱纯化重组 CtpA蛋白的SDS-PAGE电泳结果Fig.5 12% SDS-PAGE analysis of the recombinant CtpA purified by Ni-NTA affinity chromatography column.M: protein marker; 1: induced supernatant; 2: flow-through sample; 3: elution with binding buffer; 4: elution with 50 mmol/L imidazole; 5:elution with 100 mmol/L imidazole; 6: elution with 150 mmol/L imidazole; 7: elution with 200 mmol/L imidazole; 8: elution with 500 mmol/L imidazole; 9: elution with 1 mol/L imidazole; 10:Western blotting image.

以合成的D1前体蛋白羧基端延伸的24肽作为模拟底物，测定了蛋白酶的生物活性。由于蛋白酶能够将 24肽水解生成 9肽和 15肽，因此采用 C8反相柱对产物进行分离和分析，图6是水解产物在HPLC系统上的色谱分离图。由图中可以看到，24肽的吸收峰在水解反应后明显降低，同时在5.6 min处出现了一个明显的吸收峰，经过标准样品对照确认为9肽，此外在11.5 min位置也出现了一个小的吸收峰，可能为生成的15肽。根据化合物的吸收峰面积和对应的24肽浓度可测得重组D1蛋白酶的活性为 1.10 nmol/(mg·min)。

图6 HPLC对重组蛋白酶水解产物的分离和检测Fig.6 HPLC separation and determination of CtpA hydrolysis products.

2.6 重组CtpA多克隆抗体效价的检测

ELISA法检测重组 CtpA蛋白血清效价多克隆抗体，空白对照为 PBS，阴性对照为未免疫的长耳兔血清，样品为免疫后的长耳兔血清。由于未免疫的长耳兔血清没有产生颜色反应，而免疫的长耳兔血清有颜色反应，说明免疫后的长耳兔产生了针对本实验抗原的抗体。ELISA结果表明从 l∶10到1∶100 000的各个稀释度的抗体与重组的 CtpA蛋白有反应，抗体效价达1∶100 000(表1)。

表1 ELISA测定重组CtpA蛋白血清抗体效价Table 1 Potency of serum antibody against recombinant CtpA analyzed by ELISA

3 讨论

由于 D1蛋白酶在植物体中剪切 D1前体蛋白(pD1)中C端延伸的多肽(8～16个氨基酸残基)，使之成为成熟的D1蛋白，进一步用于光合系统II中锰簇合物的组装，具有维持光合系统II的损伤-修复循环过程的重要作用，因此近年来引起了人们的广泛关注，被认为是一个新型优异的广谱除草剂作用靶标，国内外部分学者已经开始进行针对该蛋白酶的药物分子设计和合成工作[10-12]。为了对合成的抑制剂先导化合物进行活性评价和筛选，需要进行必要的酶活性分析。虽然文献先后报道了从斜生栅藻以及菠菜叶绿体中提取D1蛋白酶的方法，包括类囊体的提取、超声破碎、羟基磷灰石吸附层析、阴离子交换层析、分子筛层析等方法[7-8,13]，但是由于D1蛋白酶在天然蛋白中的含量较低(如菠菜中的 D1蛋白酶仅占可溶蛋白的0.06%)，从生物组织中提取天然蛋白酶不仅操作繁琐、纯化周期长，而且所能提取得到的酶蛋白总量也有限，远不能满足化合物的高通量筛选要求，而采用基因工程方法获得可溶性表达的重组蛋白则可以解决这些难题。Inagaki等[14]和 Fabbri等[8]先后采用 pET 15b(+)和 Pet-30a载体克隆表达了菠菜的 CtpA蛋白，Liao等则表达了斜生栅藻的 CtpA蛋白[15]，但均只获得了包涵体形式的蛋白，需要进行变复性处理方能获得具有部分活性的酶蛋白。本实验根据开发以D1蛋白酶为靶标的新型农药的实际需要，从菠菜中提取总RNA和合成cDNA，并用PCR扩增CtpA的全长序列基因，将其分别与 pMD18-T载体和 pET-28a载体进行连接，构建了CtpA蛋白的重组融合表达质粒，并在大肠杆菌中进行了高效表达。虽然融合蛋白也主要以包涵体形式表达，但是通过降低诱导剂的使用量和降低表达温度等条件获得了可溶性的重组蛋白酶，并采用亲和层析和凝胶过滤层析对重组蛋白进行了纯化，Western印迹结果证实纯化后的蛋白为带有His-tag的重组蛋白。

D1蛋白由质体psbA基因编码，在植物类囊体中以前体蛋白(pD1)的形式表达。对43种psbA基因的序列比对分析表明，D1蛋白虽然在C端的延伸序列长度不一，但是它未剪切的序列却高度保守[16]。D1蛋白酶主要酶切Ala-Ala或Ala-Ser之间的肽键，例如菠菜 D1蛋白酶的剪切作用位点是 pD1中Ala-344和 Ala-345之间的肽键[13]。Taguchi等合成了不同长度含有 pD1剪切位点附近保守区氨基酸序列的多肽化合物，系统比较了剪切位点附近各保守氨基酸残基对酶分子与底物识别影响的一般规律[9,17]，发现作为模拟底物，合成小肽的长度至少需要11个残基以上才能检测到蛋白酶的水解活性，当多肽长度在 19个残基以上时对蛋白酶的酶学常数(Km和 Vmax)没有明显影响。以 Gly、Val、Pro残基取代 Ala残基后，蛋白酶的活性分别下降至50%、30%、0%，而以 Cys、Phe和 Ser残基取代Ala后，对蛋白酶的水解活性没有明显影响，表明蛋白酶对水解底物具有一定的选择性。本实验根据文献报道，采用合成的pD1羧基端24肽作为模拟底物，测定了重组D1蛋白酶的生物活性，发现蛋白酶可以将24肽水解生成9肽和15肽，其活性可达1.10 nmol/(mg·min)，是文献报道数据的 15倍[8]。Fabbri等采用盐酸胍对表达后的包涵体蛋白进行变性处理，再通过柱层析方法对蛋白酶进行复性，所得蛋白酶的活性仅为0.07 nmol/(mg·min)[8]。由于得到的为可溶性形式表达的蛋白酶，无需变复性处理，因此其活性要高于Fabbri等的结果。本实验还成功制备了 CtpA蛋白高效价的特异性多克隆抗体，对进一步研究 CtpA蛋白的表达模式和植物CtpA突变体的研究都有重要意义。

本实验通过优化表达，获得了具有较高生物活性的重组蛋白酶并成功地制备了高效价的多克隆抗体，为下一步的抑制剂先导化合物筛选以及化合物与酶蛋白的作用机理研究提供了必要的基础，目前相关的研究工作正在进行中。

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Cloning, expression, purification of spinach carboxyl-terminal processing protease of D1 protein with hydrolysis activity and preparation of polyclonal antibody

Hui Li1*, Wei Zhang1*, Mingxia Sheng1, Weiguo Li2, Yanli Liu1, Sufang Liu2, and Chao Qi1
1 Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation & Integrative Biology, College of Life Science, Central China Normal University, Wuhan 430079, China 2 Key Laboratory of Pesticide & Chemical Biology, Ministry of Education, College of Chemistry, Central China Normal University, Wuhan 430079, China

Received:November 8, 2009;Accepted:February 2, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.20702017, 30670429), Key Project of Chinese Ministry of Education(No.107082),Natural Science Foundation of Hubei Province of China(No.2007ABA141).*These authors contributed equally to this study.

Corresponding author:Weiguo Li.E-mail: weiguoli@mail.ccnu.edu.cn Chao Qi.Tel: +86-27-67862703; E-mail: qichao@mail.ccnu.edu.cn国家自然科学基金(Nos.20702017, 30670429), 教育部科学技术研究重点项目(No.107082)，湖北省自然科学基金(No.2007ABA141)资助。