“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”实验改进与优化

摘要：本文通过优化实验步骤、精简操作环节、巧用实验装置、可视实验结果、创新数据分析等对PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定实验进行优化。实验改进能更好地优化课堂教学结构，帮助学生建立科学探究的基本方法，提升实验数据的分析能力，从而有效提升学生的生物学学科核心素养。

关键词：PCR;凝胶电泳；内参照；人类SRY基因

文章编号：1003-7586（2024）02-0062-03 中图分类号：G633.91 文献标识码：B

“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”实验是浙科版普通高中教科书《生物学·选择性必修3·生物技术与工程》（以下简称“教材”）第4章第1节内容，本实验是基于学生对DNA双螺旋结构及半保留复制过程等模块知识的延伸和实践应用。实际教学中常因实验步骤繁琐、实验耗时长、对教师操作要求高等原因，使得实验“开展率”较低。为了突破教学难点，对本实验进行改进和优化，通过优化实验步骤、精简操作环节、创新实验装置、可视实验结果、巧用数据分析等，让学生更好地体会生物学学科的实用性，在解决实际问题的过程中激发学生对生命科学的热爱。

1 教材实验问题

本活动包含“PCR扩增DNA片段”和“琼脂糖凝胶电泳与鉴定”两个实验。在实际操作过程中存在以下问题：实验耗时长，PCR扩增、制胶、电泳、染色和脱色等步骤至少需3h；实验缺少对照导致结果不够严谨；条带大小判断较主观，对DNA Marker条带利用不充分；静置脱色较慢，实验效率较低；凝胶背景模糊。同时，教材中实验以验证性实验的形式呈现，留给学生主动思考和探究的内容较少。基于以上原因，对本实验进行改进和优化，以提升实验的可操作性和科学性。

2 实验操作过程

2.1 实验原理

SRY基因是启动男性睾丸发育的主要基因。人类SRY基因位于Y染色体短臂Yp11.3，仅含一个外显子，无内含子。本实验选择人类基因组为模板进行PCR扩增，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因为内参照。结果同时扩增出SRY和GAPDH基因条带，为男性样品，仅有GAPDH基因条带，则为女性样品。

2.2 实验器材

PCR仪、无菌PCR管、移液枪、电泳仪、电泳槽、凝胶槽、离心机、EP管、细胞裂解液、琼脂粉、电泳缓冲液、无水酒精、亚甲基蓝、上样缓冲液、DNA Marker5000、蛋白酶K缓冲液、TE缓冲液，引物如表1所示。

2.3 口腔上皮细胞基因组粗提取

实验前选取兴趣小组男女生志愿者各一名，用生理盐水漱口1 min。将漱口水转移至离心管中，13 000转离心1 min，弃上清液。每个离心管内分别加入200 μL细胞裂解液和50 μL蛋白酶K吹打混匀。13 000转离心1 min，上清液转移至无菌离心管，加入400 μL无菌水放人-20℃冰箱保存。

2.4 PCR扩增DNA片段

实验前隐去基因组性别标记，用“甲”和“乙”代替。学生四人一组，每人取两支无菌PCR管，分别用于扩增SRY和GAPDH基因片段，每人扩增模板需取自同一性别样品。为方便结果对比，组内两人取“甲”为模板，另两人取“乙”为模板。向无菌PCR管中依次加入模板、引物、Taq酶等试剂，最后将全班的PCR管放人PCR仪中，按图1设定反应程序进行扩增。

2.5 凝胶电泳及染色观察

制胶：称取琼脂粉1.0 g，加到盛有100 mL电泳缓冲液的三角瓶中。用封口膜封紧，微波炉加热至充分溶解，倒入凝胶槽并立即插上胶梳。冷凝后轻拔胶梳，取出凝胶置于电泳槽内，上样孔靠近负极侧，往电泳槽内加入电泳缓冲液，使之刚好没过凝胶。

上样：PCR扩增实验完成后取出PCR反应管，每管加入10 μL上样缓冲液，吹打混匀。每块凝胶的第一个上样孔内加入20 μL DNA Marker 5000，其余上样孔依次加入20 μL样品。

电泳：连接好电泳仪电极，盖好电泳槽盖，恒压150V条件下电泳18 min。

染色：电泳结束后，将凝胶转移至浓度0.1%亚甲基蓝染液中，染液没过凝胶，染色8 min。

脱色：取出凝胶，加入75%酒精脱色1.5 min;倒去酒精；加入蒸馏水放置摇床中脱色至出现蓝色条带，观察并分析实验结果，并在组内、组间交流讨论。

3 实验改进与优化

3.1 缩短实验时间，提高实验效率

本实验开出率较低，主要是因为实验耗时较长。浙科版新版教材选择扩增酵母菌的某基因片段，其长度长达841 bp，整个实验流程下来至少需4个课时，课程安排较为困难。实验改进后选择扩增人类SRY和GAPDH部分基因，长度分别为239 bp和554bp。变性、退火、延伸时长均从1min缩短至30 s，预热和终延伸时长缩短至3 min。兴趣小组在预实验时对比30轮和33轮循环扩增结果发现无明显差异，故循环减少至30轮。以上改进从整体上缩短了实验时间，同时也提升了实验的可操作性。

3.2 引入内参照，确保实验科学性

对照原则是中学生物学实验设计中最常用的原则，引入对照组能使实验更为科学严谨。实验前，教师布置相关问题：为何还要同时扩增GAPDH基因片段？能否仅根据SRY基因片段进行性别判定？学生讨论得知人为操作因素会影响实验结果，不能仅参照SRY基因片段，所以引入内参照对实验来说至关重要。本次实验引入GAPDH基因作为内参照，GAPDH基因男女性均有，为管家基因（Housekeeping），序列高度保守，几乎在所有组织中呈高水平、恒定表达，常用作蛋白质、RNA、DNA等分子生物学相关实验的标准化内参照。实验中每个学生都完成两个PCR反应体系，从某小组实验结果（见图2A）明显能看出“A1号”和“A4号”为“男性”样品；“A2号”和“A3号”为“女性”样品，该小组成员都扩增出GAPDH基因片段，说明本组操作较为规范。

3.3 合并样品上样，增强实验现象

预实验中学生常因移液枪使用不够熟悉，易将上样孔戳穿导致样品外溢，再次上样时发现上样孔“不够用”，重新制胶又需较长时间。如果SRY和GAPDH基因扩增产物上样到不同泳道，则会导致实验现象不够直观。针对以上问题，教师提问：能否将不同基因片段合并混匀后加入到同一上样孔中？电泳时不同基因片段是否会相互干扰？学生根据所学知识讨论得出：影响电泳的主要因素是基因片段长度、形状和所带电荷数，不同基因片段混合后电泳不会相互影响，电泳是分离基因片段的常用方法。本次改进既节约上样孔，又使得实验现象更直观，能直接对同一泳道中两个条带进行观察比较（见图2B）。

3.4 建构数学模型，表征实验结果

观察条带时，学生主要通过比对临近Marker条带的大小，粗略估算出条带长度。教师提问：①如果DNA条带位于两条Marker条带中间，如何准确计算其长度？②实验中有8个Marker条带，多数学生仅用到两条条带，其他条带是否蕴含有重要信息？③已知DNA片段长度的对数值与电泳迁移距离呈负相关，能否利用构建数学模型的方法准确计算片段长度？在分析讨论以上问题后，组内学生测量上样孔与各Marker条带的距离，即迁移距离，计算全班的数值平均值计入表2。

运用Excel软件对Marker迁移距离和片段长度的对数值进行散点图绘制，选中“散点”并添加“趋势线”获得如图3所示曲线。结果显示R2值达到0．9939，说明趋势线与数据的拟合度较好。将目的条带迁移距离代入公式换算，得出片段长度分别约为250bp和549 bp，与实际长度239 bp和554 bp较为接近。以上改进既克服了片段估算的盲目性，使实验更加严谨，又提升了学生构建数学模型的能力。

3.5 巧用实验器材，提升实验效果

因仪器设备限制，鼓励学生充分利用现有设备提升实验效果。如在观察染色结果时，凝胶中残留亚甲基蓝且凝胶厚度不均导致背景较深，从而影响观察和拍照效果。学生提议将凝胶放置于更为平整的台灯面上方，手动调整台灯亮度，使得条带更为清晰干净（见图4）。脱色处理时，教材建议将凝胶放入蒸馏水中静置脱色。预实验时对比静置脱色和摇床转动脱色的效果，结果显示摇床中脱色使得条带更加清晰，并且可通过调节摇床转速和温度提升脱色效率。

4 实验小结

通过优化和改进实验步骤，有效解决了教材中实验操作耗时长、实验现象不明显、实验结果不理想等问题，避免了因实验不成功而降低学生学习积极性的情况。根据实验情况及时调整实验步骤，如“口腔上皮细胞基因组粗提取”实验可在课前完成，将基因组冻存于-20℃冰箱，PCR扩增和凝胶电泳及观察可在“连堂课”完成，其中PCR扩增时长约45 min。在等待PCR扩增的过程中，可配制电泳缓冲液、亚甲基蓝染液和凝胶等。此外，由于本活动中需手动测量DNA迁移距离，导致测距误差较大，可以汇总全班数据取平均值以减小实验误差。

实验教学不仅是生物学课程的特点，更是促成学生达成生物学学科核心素养的重要支撑，本实验过程中教师需要有效组织学生合作交流，发展科学思维，培养质疑精神，提升创新能力。

基金项目：2022年度浙江省教师教育规划课题“基于课程综合化的高中生物学情景教学与实践”（ZX2022041）。