胶东地区规模鸡场3种主要病毒感染情况的调查*

徐守振,王 光,郭艳艳,尹燕博*

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛 266109;2.青岛澳兰百特生物工程有限公司,山东青岛 266101)

随着山东省养鸡业的持续发展,集约化程度的不断提高,鸡主要疾病的发生与流行也随之不断变化。有关资料表明,传染病仍是目前危害山东省家禽业的大敌,约占禽病发生总数的75%,尤其是禽流感(AI)、新城疫(ND)和鸡传染性支气管炎(IB)等病毒性疾病,是危害山东省养鸡业发展的几种主要传染病[1]。近年来,这几种病毒病呈现出非典型化、多重感染、混合感染和继发感染等特点,给禽病的诊断与防控工作带来很多困难。

为明确山东省鸡群AI、ND和IB的分布和流行特点,本试验采用已建立的RT-PCR诊断技术,对2008年1月至2009年6月山东胶东主要养鸡地区(潍坊、青岛和烟台)送检的具有呼吸道症状鸡的病料进行了3种病毒的感染情况调查。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2008年1月～2009年 6月,收集送检的来自山东省3个主要养鸡地区(潍坊、青岛和烟台)规模化鸡场疑似患有呼吸道疾病的自然发病鸡病料,共计1 837份。

1.1.2 主要试剂 Tis-饱和酚氯仿为国产试剂;Taq DNA 聚合酶 、dNTPs、DNA Marker DL 2 000均购自宝生物工程(大连)有限公司;总 RNA抽提试剂T rizol购自Invitrogen公司;M-mLV反转录酶购自Promega公司;RNase inhibitor购自Toyobo公司。

1.1.3 引物 根据GenBank已发表的序列,应用DNA Star和 DNA Man软件对 NDV的F基因、IBV的S基因和AIV(H 9)的HA基因序列进行同源性分析,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件对各自保守区设计引物,通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST对其特异性鉴定表明,3对引物均具有良好的特异性。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 病料的处理 将病料充分匀浆(与PBS 1∶5)后,反复冻融 3次～4次,12 000 r/min离心15 min,取上清-20℃保存备用。

1.2.2 病毒总RNA的抽提 1.5 mL离心管内加入600μL Trizol裂解液,后加400μL病料,反复颠倒几次混匀。加入400μL氯仿,颠倒混匀,-20℃沉淀10 min。12 000 r/min离心10 min,取上清,再加入800μL异丙醇混匀,-20℃沉淀 30 min。12 000 r/min离心 10 min,弃上清,再加入750 mL/L冷乙醇1 000μL,冲洗1次～2次。晾干后,用无RNase水30μL溶解,-70℃冻存备用或即用。

1.2.3 cDNA的合成(RT) 病毒RNA反转录反应体系为20μL,其中RNA模板 4μL,5×buffer 4μL,dNTPs(10mmol/L each)2 μL,RNase Inhibitor(10 U/μL)1μL,3种病毒基因序列特异的下游引物(25 pmo l/μL)各 1 μL,M-mLV(200 U/μL)1μL,DEPC 灭 菌 水 7μL,轻轻 吹 打混 匀,1 000 r/min离心1 min,在PCR仪上进行以下循环:42℃60 min,98℃5 min,反应后瞬间离心,反应液-20℃保存备用。

1.2.4 目的基因片段的PCR扩增 采用山东省预防兽医学重点实验室已建立的PCR反应体系[2]:模板 2.0μL,10×PCR buffer 3.0μL,dNTPs(2.5 mmol/L)2.5μL,M gC l2(25 mm ol/L)4.0μL,3种序列的上下游引物(25 pmol/μL)各 0.5μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,加 H 2 O 至30μL,吹打混匀后瞬时离心。PCR反应参数:94.5℃预变性2 min;94.5℃30 s;55℃40 s;72℃1.5 min,共35个循环;72℃再延伸9 min。反应结束后取5μLPCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,在凝胶成像系统上观察。

1.2.5 调查结果的统计分析 按照疾病在不同时间段,不同地区的发生和流行情况以及混合感染等情况,对调查结果进行统计分析。

表 1 PCR引物Table1 Primers for PCR

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果

应用建立的 RT-PCR方法对2008年1月份至2009年6月份期间来自潍坊、青岛和烟台三地区的1 837份病料进行了检测,结果从227份病料中扩增出NDV预期的目的基因片段,从226份病料中扩增出IBV预期的目的基因片段,从755份病料中扩增出A IV(H 9)预期的目的基因片段,病料扩增片段均与阳性对照所扩增出的片段完全一致。部分病料扩增电泳结果见图1。

图1 部分病料的RT-PCR扩增产物电泳结果Fig.1 The electropho resis results of RT-PCR productsof some samples

2.2 NDV、IBV和A IV(H 9)总感染情况

送检的1 837份病料中可检出NDV、IBV和AIV(H 9)中的一种或多种,阳性率高达65.76%,其中NDV平均阳性率为 12.36%,IBV阳性率为12.30%,A IV(H 9)阳性率为41.10%,说明该段时间NDV、IBV和A IV(H 9)3种病毒在胶东主要养鸡地区中普遍存在,且以AIV(H 9)感染最为严重(表2)。

表2 NDV、IBV和A IV(H 9)的检测结果Table2 The detection resu lts of NDV,IBV and A IV(H 9)

2.3 不同地区各病毒感染情况

2008年1月至2009年6月期间,潍坊地区共送检病料396份,NDV、IBV和AIV(H 9)的阳性率分别为11.87%、3.54%和42.42%;青岛地区共送检病料996份,NDV、IBV和A IV(H 9)的阳性率分别为13.45%、17.37%和44.08%;烟台地区共送检病料445份,NDV、IBV和A IV(H9)的阳性率分别为10.33%、8.76%和33.26%(表3)。从检出结果可以看出,三地区的鸡场3种病毒的感染比较普遍,但各地区不同病毒感染的情况稍有差异,青岛地区NDV、IBV 和AIV(H 9)的阳性率均为最高,潍坊地区IBV的阳性率最低,烟台地区AIV(H9)阳性率最低。

表3 不同地区3种病毒的检出结果Table3 The detection results of three viruses in different regions

2.4 不同月份各病毒感染情况

同一年的不同月份3种病毒感染情况有所不同,2008全年3种病毒感染的高峰都集中在下半年,其中7月NDV阳性率最高为32.00%,9月IBV阳性率最高为26.88%,11月AIV(H9)阳性率最高为50.00%;2009上半年中,5月份NDV阳性率最高为14.29%,4月份IBV阳性率最高为19.44%,2月份AIV(H 9)阳性率最高为62.20%(表4)。总体看来,寒冷月份3种病毒的感染率都相对较高,说明3种疾病的发生与气温有一定关系。

送检病料中,2008全年3种病毒的阳性率合计为64.64%,其中2008年上半年阳性率为54.72%,2008年下半年阳性率为73.22;2009上半年3种病毒的阳性率为68.05%。2008下半年NDV、IBV和A IV(H 9)阳性率较2008年上半年都有所升高,以A IV(H 9)升高最为显著;2009年上半年NDV阳性率较2008年上半年下降,而IBV和AIV(H9)发病率上升,且以A IV(H 9)发病率上升最为显著(图2)。总观来看,在2008年1月至2009年6月期间AIV(H 9)阳性率一直处于上升趋势中,尤其要引起足够重视。

表4 不同月份3种病毒的检出结果Table4 The detection resu lts of three viruses in differentmon ths

图2 不同时段3种病毒阳性率对比图Fig.2 The comparison of positive rate of th ree viruses in different period of time

2.5 3种病毒混合感染情况

送检病料中NDV、IBV和AIV(H 9)混合感染的现象比较普遍,二重和三重感染阳性率合计达11.00%。二重感染阳性率为10.13%,其中NDV+IBV占1.58%,NDV+A IV(H9)占3.92%,IBV+A IV(H 9)占4.63%;NDV+IBV+A IV(H 9)三重感染阳性率为 0.87%。混合感染中,以 IBV+AIV(H 9)二重混合感染最为严重(表5)。

表5 3种病毒混合感染的检测结果Table5 The detection results of co-infectionsof th ree viruses

3 讨论

鸡病毒病的实验室诊断方法很多,常用的有病毒分离鉴定、血凝(抑制)试验、中和试验、免疫荧光和ELISA等方法,这些方法存在操作技术复杂,周期较长,特异性低、敏感性差等缺点,不易于大规模普查,在发生急性疫情或混合感染、隐性感染时,往往不能获得满意的效果[3]。PCR技术具有敏感性高、特异性好、快速简便等特点,尤其对微量的样品或难以用组织培养的方法获得多量病毒样品的检测具有一定的优势,已广泛用于许多病毒和细菌的快速诊断与流行病学调查[4]。本次调查应用建立的RT-PCR技术对山东潍坊、青岛和烟台地区的规模鸡场1 837份病料进行了NDV、IBV和AIV(H 9)检测调查。结果表明,所建立的PCR技术具有快速、敏感、特异、稳定等特点,用该技术对这些疾病进行早期诊断、流行病学调查,可为鸡传染病的防控提供重要依据。

本调查通过近一年半的时间,对山东胶东3个主要养鸡地区规模鸡场送检的1 837份病例进行了3种病毒感染情况调查,发现商业鸡群中该3种病毒性疾病均有不同程度的发生和流行,阳性率由高到低依次为AIV(H 9)、IBV和NDV。2008年1月至2009年6月期间,潍坊、青岛和烟台三地区 AIV(H 9)的感染率可达48.34%,表明A IV(H 9)在山东省主要养鸡地区普遍存在,且处于高发病状态。AIV(H 9)虽然一般为低致病性,但在我国鸡群分布广泛,发病率一直居高不下,造成宿主的免疫抑制及与其他致病微生物产生协同作用等,给养禽业带来危害[5-6]。虽然山东省3个地区鸡场3种病毒的感染和流行普遍存在,但各地区的流行情况稍有差异。青岛地区NDV、IBV和AIV(H 9)的阳性率均为最高,分别为 13.45%、17.37%和 44.08%;潍坊地区IBV的阳性率最低,烟台地区AIV(H 9)阳性率最低。这可能与各地区3种疾病既往的流行病史、饲养管理和预防控制等措施密切相关。潍坊、青岛和烟台三地区在地域上紧密相连,而且交流频繁有关,但该3种病毒感染是否与地域有直接的关系,还有待进一步研究。从送检病料的发病月份看,三种疾病的发生与季节有一定关系,不同月份3种疾病的发生和流行稍有差异。寒冷月份送检的病料最多,而且三种病毒的阳性率都相对较高,说明寒冷季节是鸡呼吸道疾病的多发季节,尤其以AIV(H 9)为甚。2008下半年NDV、IBV和AIV(H 9)阳性率较2008年上半年都有所升高,以A IV(H 9)升高最为显著;2009年上半年NDV阳性率较2008年上半年下降,而 IBV和A IV(H 9)发病率上升,且以AIV(H 9)发病率上升最为显著。尤其要引起足够重视的是2008年1月至2009年6月期间AIV(H 9)阳性率一直处于上升趋势中,该病毒是否在2009下半年继续处于上升的流行趋势中这应引起我们的足够警惕,应采取有效措施防患于未然。本试验调查结果初步揭示了ND、IB和AI(H9)是造成山东省胶东地区当前鸡场呼吸道疾病经济损失的主要疾病,这为有效预防和控制胶东地区鸡场的主要疫病提供科学依据。

NDV、IBV和A I(H 9)是当前规模鸡场的主要疫病,不但可以单一感染,还可以混合感染或继发感染[7]。送检病料中NDV、IBV和AIV(H 9)混合感染的现象比较普遍,二重、三重感染的阳性率合计达11.00%,其中二重感染、三重感染阳性率分别为10.13%和 0.87%,以 IBV+AIV(H 9)和 NDV+A IV(H9)二重感染最为常见,NDV+IBV+AIV(H 9)三重感染也有存在。引起疾病混合感染的原因很多,其中一个很重要原因是一种免疫抑制性疾病的发生可对另一种或多种免疫抑制性疾病的发生有促进作用。AI和ND能引起鸡一定程度的免疫抑制,免疫系统发育未成熟的雏鸡感染后,损伤机体的免疫系统,增加了其他病原体的感染力和致病力,造成混合感染的严重后果,不但直接影响鸡群的生长发育,加剧病鸡的临床症状,提高了发病率和死亡率,导致致病性细菌继发感染,而且使疫苗免疫效果不佳甚至免疫失败,使鸡病更加复杂和严重,加大了防控的难度[8-10]。因此,应该针对山东省胶东三地区鸡的3种病毒混合感染流行现状采取综合性的防控措施。

[1]王洪利.2000-2002年山东省鸡主要病毒病流行情况调查[D].江苏南京:南京农业大学动物医学院,2004.

[2]张 毅,尹燕博,韩丽敏,等.2007-2008年同一地点H9N2亚型禽流感病毒连续分离毒株 HA基因序列分析[J].中国兽医杂志,2009,45(5):18-20.

[3]张蓉蓉,罗青平,温国元,等.禽流感诊断方法研究进展[J].安徽农业科学,2009,37(22):10507-10510.

[4]杨克礼,韦 平,潘 玲,等.安徽省鸡免疫抑制性疾病的流行病学调查[J].中国兽医科技,2005,35(8):665-670.

[5]Biswas P K,Christensen JP,Ahmed S S,et al.Avian influenza ou tb reaks in chickens,Bangladesh[J].Em erg Infect Dis,2008,14(12):9-12.

[6]W an H Q,Sor rell EM.Replication and transmission of H 9N2 influenza viruses in ferrets:evaluation of pandem ic potential[J].Plos One,2008,3(8):1-13.

[7]殷秀玲.冬春季节家禽呼吸道疾病的诱发原因及防制措施[J].中国家禽,2009,31(3):50-51.

[8]韦 平,丁家波.几种引起家禽免疫抑制的病毒性疾病及其作用机理[J].中国预防兽医学报,2000,22(4):316-318.

[9]崔治中.鸡群中免疫抑制性病毒、蛋传病毒的多重感染[J].中国家禽,2000,22(5):17-18.

[10]李连任.我国鸡群免疫抑制性疾病的流行现状与防制对策[J].中国动物保健,2005(1):18-19.