牛结核胶体金免疫层析快速诊断方法的建立及初步应用*

冯向辉,王建永,包永占,赵月兰,左玉柱,秦建华*

(1.河北农业大学动物科技学院,河北保定 071001;2.河北农业大学中兽医学院,河北定州 073000)

牛结核病是由分支杆菌引起的人兽共患的慢性消耗性传染病。该病的流行与传播不仅阻碍着畜牧业的发展,而且严重的威胁到食品安全和公共卫生[1]。消灭牛结核的惟一方法是通过“检疫—扑杀”措施淘汰阳性牛,因此,准确而及时的诊断方法对该病的控制尤为重要。结核菌素皮内变态反应(tubercu lin skin test,TST)是世界动物卫生组织推荐的牛结核病的诊断方法,但该方法存在明显的不足之处,即检测时易受其他非致病性的分支杆菌的干扰而出现假阳性;感染后期的病牛不敏感;易受人为操作因素影响;对受试牛刺激大等[2-4]。此外,牛结核病的诊断还有细菌培养法、γ-干扰素诊断法和分子生物学检测[5]等方法,但细菌培养法耗时长,检出率低,敏感性差[6];γ-干扰素诊断法成本高,收集的血样需短时间内进行检测;分子生物学检测技术需要贵重的仪器设备,技术复杂,对实验室和操作人员的要求较高,这些诊断方法在牛结核病普查中难以应用。

免疫层析技术(immunochromatographic assay,ICA)是20世纪90年代兴起的一项免疫学检测技术,该技术特异性强、敏感性高,而且不需昂贵仪器设备,操作简单快速,适合于基层兽医检测[7]。

MPB70、MPB83、ESAT-6是牛分支杆菌主要的特异性分泌抗原,应用这些抗原检测牛结核病具有很高的特异性,联合使用时可以提高检测的灵敏度[8-9]。本研究利用筛选出的 MPB70、MPB83、ESA T-6中的抗原表位经原核表达的重组蛋白建立了一种检测结核病的间接胶体金免疫层析法,该方法具有灵敏度高,特异性好等优点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 抗原和血清 牛分支杆菌抗原蛋白MPB70-83-ESAT-6,由河北农业大学动物科技学院寄生虫实验室克隆、表达并提纯和保存。金标记兔抗牛IgG,购自北京博奥森生物技术有限公司。标准牛结核阳性血清,采自经TST和细菌学检验均为阳性的结核病牛。牛副结核病阳性血清购自中国兽医药品监察所。口蹄疫和牛传染性鼻气管炎阳性血清为河北农业大学动物科技学院寄生虫实验室保存。样本血清,采自河北省多个奶牛场TST检测后的奶牛。

1.1.2 主要试剂及材料 牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司;硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、样品垫、吸收垫均购自上海金标生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 检测线抗原和质控线抗体的包被 以原核表达并提纯的重组蛋白MPB70-83-ESAT-6作为硝酸纤维素膜上的检测线包被抗原。将蛋白MPB70-83-ESAT-6用 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)稀释至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 m g/mL,置-20 ℃贮存备用。鼠抗兔IgG作为硝酸纤维素膜上的质控线包被抗体。将稀释后的MPB70-83-ESA T-6蛋白和鼠抗兔 IgG以每厘米0.80μL分别喷到黏附在PVP底板上的硝酸纤维素膜的检测线和质控线上,37℃烘干,室温干燥贮存备用。

1.2.2 金标垫的制备 将金标记兔抗牛 IgG用Bio-Dot点膜仪以每厘米50μL的量喷到玻璃纤维素膜上,冷冻真空抽干后,室温干燥贮存备用。

1.2.3 样品垫的处理 将样品垫浸泡于0.01 mo1/L pH 7.4磷酸缓冲液(20 g BSA,25 g海藻糖,3 g PVP-40,0.2 g NaN3,8 g NaCl,0.2 g KC l,2.9 g N a2HPO4·12H2O,0.2 g KH2PO4,用去离子水定容至1 000 mL)中30min后,于37℃烘干,真空封装,置 4℃备用。

1.2.4 试纸条的组装 如图1所示,先将硝酸纤维素膜粘贴到PVP底板的相应位置,然后将样品垫,金标垫,吸收垫依次粘贴到PVP底板的相应位置,使金标垫与吸收垫与硝酸纤维素膜部分接触,将其切成4mm宽,室温干燥贮存备用。

图1 胶体金免疫层析试纸条的组装示意图Fig.1 The assembly of gold colloid imm unoch rom atographic strip

1.2.5 检测方法及结果判定 取150μL待检血清滴加在试纸条的加样孔中,15 min内读取结果。检测线和质控线上均出现红色条带时判断为阳性,质控线上出现红色条带而检测线上无条带时判为阴性,如果质控线上没有条带出现则检测无效。

1.2.6 特异性检验 用制备好的牛结核抗体检测试纸条分别检测牛结核阳性与阴性血清、牛副结核病、牛巴贝斯虫病、牛口蹄疫和牛传染性鼻气管炎阳性血清,进行试纸条特异性检测。

1.2.7 敏感性检验 将1份牛结核病阳性血清用生理盐水倍比稀释,用能检测出阳性信号的血清最高稀释倍数作为检测敏感度。

1.2.8 临床样本检测 按优化的试验条件制备免疫胶体金试纸条,检测285份血清样本,同时与结核菌素皮内变态反应(TST)进行比较。

2 结果

2.1 检测线抗原和质控线抗原最佳包被浓度的确定

分别以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL 6种不同浓度的重组蛋白MPB70-83-ESAT-6包被硝酸纤维素膜上的检测线,随着抗原包被浓度的增加,检测线的颜色逐渐加深,在到达2.5 mg/mL以后色泽不再加深(图2),因此确定2.5 m g/mL为最佳抗原包被浓度。

2.2 试纸条特异性试验

用制备好的牛结核抗体检测试纸条分别检测牛结核病阳性血清和阴性血清、牛副结核病、牛巴贝斯病、口蹄疫和牛传染性鼻气管炎病阳性血清,该试纸条与牛结核病阳性血清作用检测线出现明显的红色条带,而与牛结核病阴性血清、牛副结核病、牛巴贝斯病、口蹄疫和牛传染性鼻气管炎病阳性血清作用检测线未见红色条带(图3),说明该试纸条具有良好的特异性。

2.3 试纸条敏感性试验

用研制的胶体金试纸条检测1份倍比稀释的牛结核病阳性血清,阳性血清最低检出稀释度为1∶640(图4)。

2.4 临床样品检测结果

用制备的牛结核病抗体快速检测试纸条检测285份经TST检测的奶牛的血清样本,结果见表1。TST阳性牛18头,其中试纸条检出13份,阳性符合率为72.22%(13/18)。TST阴性牛267头,其中试纸条检测为阴性牛215头,阴性符合率为80.52%(215/267)。总符合率为80%(13+215/285)。说明胶体金试纸条与TST具有较高的符合率。

表1 制备的试纸条与TST的比较Table1 Comparison resu lts of the test strip w ith TST

图2 不同浓度的重组蛋白包被的检测线Fig.2 The coated detection line in different density of recombinant protein

图3 试纸条特异性试验Fig.3 The specificity test of the strips

图4 试纸条敏感性试验Fig.4 The sensitivity test of the strip s

3 讨论

牛分支杆菌是典型的胞内寄生菌,机体对其产生的免疫首先是细胞免疫,之后是体液免疫,二者是分离的。因此,基于细胞免疫的迟发性变态反应检测方法(如TST),对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感,而此阶段正是结核患牛散播病原的危险时期。基于体液免疫反应的抗体检测方法正好弥补了上述缺陷。牛分支杆菌感染机体后,在生长过程中能分泌多种抗原,诱导机体产生相应抗体,其抗体水平与疾病的病程呈正相关[10]。因此检测血清中的IgG抗体的水平对于疾病的诊断有重要意义。

MPB70、MPB83是分支杆菌主要的特异性分泌抗原,可以刺激机体产生细胞免疫反应,而且引发体液免疫,具有免疫原性和免疫保护[11-12]。ESAT-6有多个T/B细胞表位,具有用于结核病早期诊断的发展前景[13-15]。这些蛋白都有用于诊断牛结核病的潜力,但在单独使用时灵敏度较低,针对这一缺陷有人尝试了联合使用多种抗原的方法,使抗体检测的灵敏度有了很大的提高,但该方法存在抗体配比不均和难于标准化生产的问题。本试验中所用的重组蛋白M PB70-83-ESAT-6是用 DNAstar对M PB70、MPB83、ESAT-6进行分析后筛选的其中抗原性高的抗原表位连接后进行表达和纯化而得。试验中组装的试纸条的敏感性试验表明,该重组蛋白对牛结核抗体的检测有较高的灵敏度,同时也避免了联合使用多种蛋白的配比不均的缺点。特异性试验显示该试纸条不与牛副结核、牛巴贝斯病、口蹄疫和牛传染性鼻气管炎病阳性血清作用,具有很好的特异性。用制备的试纸条检测285份牛血清并与TST进行比较,结果显示该试纸条与TST具有较高的符合率(80%),不同的检测机制及牛感染分支杆菌后的先以细胞免疫为主后以体液免疫为主的特性致使TST与试纸条两种检测方法的符合率存在一定的差异。在TST检测阴性试纸条检测阳性的牛中,发现有3头有明显的咳嗽消瘦症状的牛,对其中一头剖检,发现了典型的结核病病理变化,进一步证实试纸条更有利于检出感染后期的结核病牛。因此,该试纸条可单独用于牛结核病的检疫,也可与TST结合使用使检测结果更加准确可靠。

本试验建立了一种检测牛结核抗体的免疫胶体金方法,该方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可以对牛结核病进行普查和检疫,也可与TST结合使用以提高检测的准确率,具有良好的应用前景。

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