一株新型寄生溶藻细菌的分离及初步鉴定

许丽娜,程 凯＊,许 敏,赵以军,杨季芳,陈吉刚,吴庆喜

（1.华中师范大学城市水环境生态学湖北省重点实验室,武汉430079;2.浙江万里学院宁波市微生物与环境工程重点实验室,浙江宁波替换为 315100）

一株新型寄生溶藻细菌的分离及初步鉴定

许丽娜1,程 凯1＊,许 敏1,赵以军1,杨季芳2,陈吉刚2,吴庆喜2

（1.华中师范大学城市水环境生态学湖北省重点实验室,武汉430079;2.浙江万里学院宁波市微生物与环境工程重点实验室,浙江宁波替换为 315100）

从宁波象山港分离得到1株具有溶藻能力的细菌,命名为 XD-G.该菌株对中肋骨条藻（Skeletonema costatum1115）的溶藻效果较好,感染1 d后,藻细胞基本裂解,叶绿素a减少达66.5%.在透射电子显微镜下观察菌株XD-G感染9 h后的中肋骨条藻切片,发现藻细胞内有大量细菌出现,由此推测,菌株XD-G是1种寄生性溶藻细菌.菌株XD-G不但能裂解中肋骨条藻及热带骨条藻（Skeletonema troicum）,而且对赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）也有一定的溶藻效果.

赤潮;溶藻细菌;中肋骨条藻;寄生

随着我国工农业的迅速发展,沿海城市人口的急剧增长,海洋环境不断遭到破坏,水体富营养化日益加剧,赤潮发生的次数急剧增加,发生的面积和规模也不断扩大.2001年至2009年,我国发生赤潮共764次,而且自2004年起有毒赤潮频繁发生[1-9].赤潮的频繁发生极大地危害了海产养殖业和渔业资源,严重地破坏了正常的海洋生态系统,直接威胁着人类的生存环境和健康水平.因此,赤潮的监测与防治已经迫在眉睫.

我国沿海引发赤潮的生物主要是浮游植物,例如甲藻类、硅藻类、蓝藻类、金藻类等[10].目前应用的藻类控制技术主要是超声波除藻,机械收藻,粘土沉降藻等物理法[11],以及使用硫酸铜、次氯酸、过氧化氢等灭藻剂的化学法[12].但物理法控藻费用高,而且难以大面积使用,而化学法控藻容易产生二次污染,造成环境污染或生态平衡的破坏,甚至给人类带来更多危害.因此,人们把更多的目光投向了生物法控藻,其中溶藻细菌已受到许多国内外学者的关注.

研究表明,在自然水生态环境中存在着一些细菌群体,赤潮的突然消亡可能与这些细菌有密切联系,因此,溶藻细菌可能成为治理赤潮的有力工具[13].Baker K H等[14]曾发现1株假单胞菌Pseudomonas sp.T827/2B能分泌一种热稳定性的高分子物质,对海链藻（Thallasiosira pseudonana）有致死作用.郑天凌等[15]从赤潮多发区厦门西海域分离到1株巨大芽孢杆菌Bacillus mgateriumS7和1株芽孢杆菌S10,研究发现它们能分泌胞外物质抑制塔玛亚历山大藻（A lexandrium tamarense）的生长.目前,国内外报道较多是分泌胞外物质溶解海洋微藻的细菌,有关直接接触或进入海洋微藻细胞内致使藻细胞死亡的细菌报道较少。本研究从我国宁波象山港分离得到1株新型的寄生于中肋骨条藻（Skeletonema costatum）细胞内的溶藻细菌,并对其进行了初步的研究.

1 材料与方法

1.1 藻种及培养

选用利马原甲藻（Prorocentrum lima）、东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、海洋原甲藻（Prorocentrum micans）、微小原甲藻（Prorocentrum minimum）、锥状斯克里普藻（Scrippsiella trochoidea）、赤潮异弯藻（Heterosigma akashi-wo）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、中肋骨条藻、热带骨条藻（Skeletonem troicum）、旋链角毛藻（Chaetoceros curvisetus）、尖刺伪菱形藻（Psuedonitzshia pungens）.中肋骨条藻来源于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库,其余藻种来源于暨南大学赤潮与水环境研究中心.上述藻种均使用f/2液体培养基[16],置于恒温光照培养箱中静置培养,间隙振荡,温度 20±0.5℃,光照强度为2 000 lux,光暗周期比14 h∶10 h.

1.2 溶藻微生物的分离

2009年3 月,采集宁波象山港西店养殖区深度1～1.5m的表层海水10 L,冰浴,立即带回实验室.海水水样经 Sartocon Slice Cassette切向流膜包超滤系统反冲超滤浓缩100倍,即得约100 mL水样浓缩液.水样浓缩液以体积比1∶2接入上述供试藻种培养液,空白对照组添加过滤海水,将上述接有水样浓缩液的藻培养液置于20±0.5℃的恒温光照培养箱培养数天.观察藻种培养液颜色的变化,并使用光学显微镜观察藻细胞裂解情况.如对某种藻出现溶藻现象,再反复感染进行稳定性感染测试,对能够连续稳定感染5次以上者进行下述研究.

1.3 溶藻微生物的溶藻效果

按上述方法分离得到溶中肋骨条藻的微生物.将中肋骨条藻裂解液按1%的体积比接种至对数期的中肋骨条藻培养液中,空白对照组加入过滤海水,使用丙酮法测定感染前及感染1 d后的叶绿素a含量[17],同时在光学显微镜下观察对照组及实验组藻细胞的变化.

1.4 溶藻方式初探

感染了XD-G的中肋骨条藻裂解液经孔径为0.22μm的Millipore Millex-GP针头式过滤器（改良聚醚砜）过滤,将裂解原液及滤液分别以体积比1∶5接种到对数生长期的中肋骨条藻培养液中,空白对照组加入过滤海水,感染1 d后,根据藻液的颜色变化判断其溶藻效果,同时在光学显微镜下观察藻细胞的显微变化.

1.5 溶藻细菌的透射电子显微镜观察

感染菌株XD-G的中肋骨条藻裂解液按1%的体积比接种至对数生长期的中肋骨条藻培养液中,空白对照组加入过滤海水.接种9 h后,分别取空白对照组及实验组的样品各4 mL,经12 000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀中加入2.5%的戊二醛,4℃下固定,固定后的样品送往中国科学院病毒研究所制备电镜切片并观察.

1.6 溶藻细菌的溶藻范围试验

感染菌株XD-G的中肋骨条藻裂解液按体积比1∶2加入到处于对数生长期的利马原甲藻、东海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、锥状斯克里普藻、赤潮异弯藻、热带骨条藻、旋链角毛藻、尖刺伪菱形藻及球等鞭金藻培养液中,每个藻种做3个平行实验,对照组加入过滤海水,置于温度为20±0.5℃的光照培养箱中.感染数天后,根据藻培养液的颜色变化及光学显微镜下观察藻细胞的变化判断其溶藻效果.

2 结果与分析

2.1 溶藻微生物的分离结果及其溶藻效果

从宁波象山港西店养殖区分离到裂解中肋骨条藻的微生物,命名为 XD-G,裂解液反复感染中肋骨条藻,藻培养液的颜色都由褐色变为浅绿色.光学显微镜下观察,空白对照组的藻细胞完整,内可见数个色素颗粒,几个单细胞由刺串成细胞长链,可见空白对照组的藻细胞生长正常.而感染XD-G的藻培养液中,藻细胞已基本裂解,细胞内物质释放在外面,可见实验组的藻细胞已裂解死亡.除藻效率以叶绿素a的减少为依据,如图1所示,感染XD-G1 d后,中肋骨条藻培养液的叶绿素a含量减少达66.5%.

图1 XD-G感染中肋骨条藻1 d的溶藻效果Fig.1 The algae-lysing effect of the XD-G to S.costatum1 115 in 1 day

2.2 溶藻方式

光学显微镜下观察,感染了XD-G的中肋骨条藻培养液中,藻细胞已基本裂解,但是,XD-G裂解液经孔径为0.22μm的Millipore Millex-GP针头式过滤器（改良聚醚砜）过滤后,其滤液对中肋骨条藻无溶藻效果,藻细胞生长正常.由此推测,该溶藻微生物既不是藻类病毒,也不是分泌胞外溶藻物质的细菌,可能是一种直接接触溶藻或者是与中肋骨条藻竞争有限营养物质溶藻的细菌.

2.3 菌株XD-G的透射电子显微镜观察结果

对照组如图2-1,可见单个藻细胞间由刺连接,藻细胞膜完整,细胞内容物丰富,可见数个线粒体,即说明对照组中肋骨条藻细胞生长正常.试验组如图2-2,可见感染菌株XD-G 9 h后实验组藻细胞内有大量细菌（箭头所指）,个别藻细胞破裂,子代细菌正在释放.由此推断,菌株XD-G是一种寄生于中肋骨条藻内生长繁殖的细菌.

图2 感染菌株XD-G 9 h的中肋骨条藻电镜切片（2-1为对照组,2-2为实验组）Fig.2 The electron microscopic section ofS.costatum 1115 after 9 hours'infection of XD-G.

2.4 菌株XD-G的溶藻范围

菌株XD-G对其它藻种的裂解情况如表1所示,可以看到菌株XD-G不但可裂解中肋骨条藻,也可裂解热带骨条藻,而且对赤潮异弯藻也有一定的溶藻效果,但是该菌株对利马原甲藻、东海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、锥状斯克里普藻、球等鞭金藻、旋链角毛藻、尖刺伪菱形藻均无溶藻效果.

表1 菌株XD-G的溶藻范围Tab.1 Algae-lysing range of the bacteria XD-G

3 讨论

细菌的溶藻机制主要分为两类:一是间接溶藻,即细菌与藻细胞竞争有限营养物质或细菌分泌胞外溶藻物质而致使藻细胞死亡;二是直接溶藻,即细菌直接接触藻细胞或进去藻细胞中而造成藻细胞裂解死亡.Caiola M G等曾[18]在瓦雷泽湖爆发的水华中,使用电子显微镜观察到直接攻击铜绿微囊藻的类蛭弧菌.Lewis J等[19]用电子显微镜观察到一种鞭毛细菌寄生于亚历山大藻（A lexandrium spp.）细胞中.

本实验所分离到的菌株XD-G不但除藻效率高,接种1 d后,除藻效率可达66.5%,而且溶藻范围也较广,除了对中肋骨条藻和热带骨条藻有高效的溶藻效果外,还能裂解赤潮异弯藻.其中中肋骨条藻和赤潮异弯藻是常发赤潮原因种,国内海域自2002年起每年都发生中肋骨条藻赤潮,特别是浙江沿海几乎每年都发生数次此类赤潮[3-9].可见本研究的现实意义非常明确.

目前,有关溶中肋骨条藻细菌的报道主要集中于分泌胞外溶藻物质的细菌.例如 Kato J等[20]从海水中分离得到4株能够裂解中肋骨条藻的交替假单胞菌A27,A28,A29,A30,并通过进一步研究证明海洋细菌Pseudoalterolnonas sp.A28是通过分泌一种胞外丝氨酸蛋白酶而溶解藻细胞的[21].由于自然水体中的营养物质有限,不利于细菌的迅速生长,因此,此类溶藻细菌一般需将细菌分泌的胞外溶藻物质工业化生产才能投入治理赤潮的实际应用,而且由于赤潮发生面积比较大,溶藻物质的需要量也会很大,一定程度上提高了赤潮治理的费用.至今为止,国内还未见关于以直接溶藻方式溶中肋骨条藻细菌的报道.国外曾有报道Cytophaga sp.J18/M01能够直接攻击中肋骨条藻,而且溶藻范围广,不但对中肋骨条藻具溶藻效果,还能溶解古老卡盾藻（Chattonella A ntique）、海洋卡盾藻（Chattonella Marina）、赤潮异弯藻、双突角毛藻（Chaetoceros didymus）、长崎裸甲藻（Gymnodinium nagasakiense）等海洋微藻[22].在溶藻范围方面,菌株 XD-G与Cytophaga sp.J18/M01相似,同时可对中肋骨条藻和赤潮异弯藻有溶藻效果,但是文献中没有明确指出Cytophaga sp.J18/M01是直接接触溶藻还是进入藻细胞溶藻.本实验分离得到的细菌XD-G经电镜切片观察初步证实能进入中肋骨条藻细胞内.目前报道进入藻细胞内的溶藻细菌主要是类蛭弧菌[18,23],这类细菌寄生在宿主细胞的周质空间内生长增殖[23-24].尽管电镜图片中显示菌株XD-G是在藻细胞内,但也不能排除细菌在周质空间中增殖,在宿主细胞即将裂解时扩散至宿主细胞内.推测该菌株可能是一种新型的寄生溶藻细菌.

菌株X-G寄生于中肋骨条藻细胞,并利用藻细胞内营养物质生长繁殖,最终致使藻细胞裂解,释放大量子代,这样在赤潮治理的过程中无需投放大量的细菌,就能达到较好的除藻目的.此外,由于菌株XD-G在我国近海海域分离得到,在治理赤潮的实际应用中的生态安全性会较高.因此,菌株XD-G可能可以成为赤潮治理的一种有力工具.但是由于赤潮的发生面积大,赤潮的生消受到多种因素的影响,要将菌株 XD-G应用于赤潮的实际治理,还需对它做很多的研究,如环境因素对其溶藻效果的影响等.

[1]国家海洋局.中国海洋灾害公报[EB/OL].2001.http://www. soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/n/webinfo/2000/01/1190166472521773.htm.

[2]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2002.http://www. soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/n/webinfo/2003/01/1190166472353539.htm.

[3]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2003.http://www. soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/n/webinfo/2004/01/1190166472161521.htm.

[4]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2004.http://www. soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/n/webinfo/2005/01/1190166471900544.htm.

[5]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2005.http://www. soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/n/webinfo/2006/01/1190166471530627.htm.

[6]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2006.http://www. soa. gov. cn/hyjww/ml/gb/l/webinfo/2007/11/1195468875225393.htm.

[7]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2007.http://www.soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/news/webinfo/2008/01/1200912281040825.htm.

[8]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2008.http://www. soa.gov.cn/hyjww/ml/gb/lb/webinfo/2009/03/1225332553351359.htm.

[9]国家海洋局.中国海洋灾难公报[EB/OL].2009.http://www. soa. gov.cn/hyjww/ml/gb/lj/webinfo/2010/03/1265846970190499.htm.

[10]沈国英,施并章.海洋生态学（第二版）[M].北京:科学出版社,2002:395.

[11]屠清瑛,章永泰,杨贤智.北京什刹海生态修复试验工程[J].湖泊科学,2004,16（1）:62-67.

[12]缪锦来,石红旗,李光友,等.赤潮灾害的发展趋势、防治技术及其研究进展[J].安全与环境学报,2002,2（3）:40-44.

[13]吴 刚,席 宇,赵以军.溶藻细菌研究的最新进展[J].环境科学研究,2002,15（5）:43-46.

[14]Baker K H,Herson D S.Interactions between the diatom Thallasiosira pseudonanna[sic]and an associated Pseudomo-nad in a mariculture system[J].Applied and Environmental Microbiology,1978,35:791-796.

[15]郑天凌,田 蕴,苏建强,等.海洋赤潮生物与厦门海域几种菌的生态关系研究[J].生态学报,1999,22（12）:2063-2070.

[16]黄 姿,李春强,于晓玲,等.一株溶藻细菌（Pseudoaltero-monas sp.）的分离鉴定及溶藻活性初探[J].海洋技术,2008,27（3）:56-60.

[17]国家环保局.水和废水监测分析方法（第四版）[M].北京:中国环境科学出版社,2002:670-671.

[18]Caiola M G,Peilegrinis S.Lysis ofMicrocystis aeruginosa by bdellovibrio-like bacteria[J].Journal ofPhycology,1984,20:471-475.

[19]Lewis J,Kennaway G,France S,et al.Bacterium-dinoflagella-te interactions:investigative microscopy ofAlexandrium spp.（Ganyaulacales,Dinophyceae）[J].Phycologia,2001,40（3）:280-285.

[20]Kato J,Amie J,Murata Y,et a1.Development of a genetic transformation system for an alga-lysing bacterium[J].Applied and Environmental Microbiology,1998,64（6）:2061-2064.

[21]Lee S,Kato J,Takiguchi N,et al.Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacteriumPseudoalteromonas sp.strain A28[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66（1）:4334-4339.

[22]Imai I,Ishida Y,Hata Y.Killing of marine phytoplankton by a gliding bacteriumChyophaga sp.isolated from the coastal sea of Japan[J].Marine Biology,1993,116:527-532.

[23]David M C,Mortimer P S.Antagonistic association of the chlorellavorus bacterium（"Bdellovibrio"chlorellavorus）withChlorella vulgaris[J].Current Microbiology,1978,1:59-64.

[24]Edouard J.The Prokaryotes[M].New York:Springer New York,2006.

Abstract:An algae-lysing bacteria called XD-G was isolated from XiangShan bay in NingBo.The algicidal effect of the bacterium XD-G onS.costatum1115 is significant:almost all of the algal cells were lysed in 24 hours,and the concentration of Chl a was reduced by 66.5%then.By electron microscope observation,a large number of the bacterium could be observed inS.costatumcells after 9 hours'infection,which means that the bacteria XD-G is a kind of parasitic bacteria.Furthermore,the bacteria XD-G could not only lyseS.costatum1115 andSkeletonema troicum,but also removeHeterosigma akashiwo.

Key words:red tide;algicidal Bacteria;Skeletonema costatum1115;parasitic

Isolation and preliminary identification of a novel parasitic algicidal bacteria

XU Lina1,CHENG Kai1,XU Min1,ZHAO Yijun1,YAN GJifang2,CHEN Jigang2,WU Qingxi2
（1.Hubei Key Laboratory of Urban Water Environmental Ecology,Huazhong Normal University,Wuhan 430079;2.Municipal Key Laboratory of Microorganism and Environmental Engineering,Zhejiang Wanli College,Ningbo,Zhejiang 315100）

X55

A

1000-1190（2010）04-0658-04

2010-07-27.

国家海洋局公益性项目（200705014）;国家科技重大专项（2009ZX27105-001）;湖北省自然科学基金项目（2008CDA101）.

＊通讯联系人.E-mail:chengkaicn@163.com.