增龄对大鼠膈肌Glut－1和Glut－4mRNA表达的影响

畅 怡，聂秀红，曹若瑾，蔡彦宁，冯 明

(1.首都医科大学宣武医院呼吸内科，北京 100053;2.首都医科大学宣武医院北京老年病研究所神经生物学研究室，北京 100053;3.首都医科大学宣武医院综合科，北京 100053)

增龄对大鼠膈肌Glut－1和Glut－4mRNA表达的影响

畅 怡1，聂秀红1，曹若瑾3，蔡彦宁2，冯 明3

(1.首都医科大学宣武医院呼吸内科，北京 100053;2.首都医科大学宣武医院北京老年病研究所神经生物学研究室，北京 100053;3.首都医科大学宣武医院综合科，北京 100053)

目的 研究大鼠膈肌Glut－1和Glut－4 mRNA的增龄变化情况，进一步探讨增龄对呼吸肌代谢及功能变化的机制。方法 雄性健康清洁级 SD大鼠24月龄7只、3月龄12只，应用RT－PCR方法检测大鼠膈肌 Glut－1、Glut－4 mRNA表达。结果 老年组大鼠Glut－1、Glut－4 mRNA表达较年轻组表达明显升高。结论 大鼠膈肌不同于单纯骨骼肌和心肌，Glut－1、Glut－4 mRNA的表达具有特殊的增龄趋势。

膈肌;葡萄糖转运蛋白;增龄;大鼠

随着年龄的增长，人的许多生理功能退化，最常见的有视力和听力的减退。然而关于骨骼肌，同样存在增龄变化如肌肉萎缩，肌肉紧张度降低，选择性的快肌纤维萎缩以及线粒体酶和糖酵解酶减少，这些改变往往可以引起摔倒，骨折和卧床，而这些问题带来很多社会问题。抑制这些增龄变化对延缓衰老非常重要［1］。

膈肌是最重要的呼吸肌，随着年龄增长膈肌功能减退。在康复方面膈肌发挥非常重要的作用，包括外科手术前后的呼吸功能康复，慢性阻塞性肺疾病的家庭氧疗和运动时心肺反应。在治疗急性或慢性呼吸系统疾病时许多康复治疗师把腹式呼吸(膈式呼吸)作为呼吸肌肉锻炼的首选。研究膈肌功能和形态的增龄变化特点对查明骨骼肌的可塑性尤为重要。换句话说，如果可以维持膈肌的功能，则可能抑制肌肉的增龄变化，降低老年人呼吸功能障碍的发生率。已有研究表明由于肌浆网钙离子－ATP酶活性和肌球蛋白重链组成改变导致老年膈肌的收缩和舒张速度减慢［1］。但目前尚无从葡萄糖代谢方面研究膈肌的增龄变化。

葡萄糖转运是糖原合成及糖酵解的限速步骤，而葡萄糖转运依靠葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，Glut)的介导发挥作用。Glut－1 及 Glut－4是膈肌主要的Gluts。Glut－1、Glut－4 mRNA 表达的年龄变化趋势受种属、组织类型、运动水平及干预方式等因素的影响［3－15］。因此，本文通过观察不同年龄组大鼠膈肌细胞内 Glut、Glut－4 mRNA表达变化，探讨增龄对膈肌细胞利用葡萄糖的影响，同时进一步探讨增龄对呼吸肌代谢及功能变化的机制。

1 材料和方法

1.1 实验方法

雄性健康SPF级SD大鼠 (北京大学医学部实验动物科学部，许可证编号 SCXK(京)2002－0001)，24月龄，7只;3月龄，12只，应用10%水合氯醛以300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，大鼠麻醉成功后，将其仰卧于平台上，伸展固定四肢。开胸腹充分暴露内脏，迅速分离完整膈肌，并立即放于液氮中速冻，后转移于－80℃冰箱中保存。

1.2 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

取1 μg总RNA，严格按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA;根据基因库中的基因序列，合成PCR引物(表1);引物扩增，扩增产物于含有0.1 mg/L溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统在紫外线下摄取电泳图谱并应用核酸定量分析软件 Quantity One(Bio－RAD)进行分析(图1);以看家基因β－actin的表达为内对照，用扩增基因/β－actin的灰度比值对该基因的表达进行半定量。

图1 β－actin 、Glut－1 和 Glut－4 mRNA 电泳示意图Fig.1 Gel electrophoresis map of RT－PCR products of β－actin，Glut－1 and Glut－4 mRNA

1.3 统计方法

采用SPSS 11.5数据统计软件进行统计分析，正态性检验采用t检验，数据采取均数±标准差(±s)表示，计量资料采用独立样本 t检验，以 P＜0.05有显著性差异标准。

2 结果

2.1 大鼠膈肌 Glut-1/β-actin 和 Glut-4/β-actin mRNA增龄变化

24月龄大鼠(aged rats)较3月龄大鼠(young rats)的 Glut－1/β－actin、Glut－4/β－actin mRNA 升高，差异有显著性意义(P＜0.01)(图2)。

图2 不同月龄大鼠膈肌 Glut－1和 Glut－4 mRNA表达Fig.2 Compared with young rats，the mRNA contents of Glut－1 and Glut－4 in diaphragm are higher in the aged rats

3 讨论

膈肌是膈式呼吸最主要的呼吸肌，并且是生命依赖的骨骼肌，因此与其他四肢骨骼肌比较，膈肌更为重要。随着年龄增长膈肌功能也减退，尤其在病理情况下老年人更易出现呼吸功能的障碍。因此研究老年膈肌的功能减退的生理机制，可以为老年呼吸功能障碍提供治疗基础。膈肌具有终身节律收缩的特点。肌肉收缩的能量来源于葡萄糖的供给，而葡萄糖转运是糖原合成及糖酵解的限速步骤。葡萄糖转运则依靠葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，Glut)的介导发挥作用。

表1 引物序列Tab.1 List of primers used for RT－PCR

Glut－1、Glut－4 mRNA 表达的年龄变化趋势受种属、组织类型、运动水平及干预方式等因素的影响［3－16］。Louis等人的研究结果表明小鼠的心肌及骨骼肌Glut－1和Glut－4 mRNA的表达随年龄的增加而增加，但成年小鼠与老年小鼠 Glut－1和 Glut－4 mRNA表达差异无显著性［13］。大鼠骨骼肌和心肌Glut－1 和 Glut－4 mRNA 表达随年龄增长而下降，心肌的 Glut－1 和 Glut－4 mRNA表达明显高于骨骼肌［10］。本文研究结果显示24月龄大鼠膈肌 Glut－1和Glut－4mRNA表达较3月龄大鼠明显增高，与上述研究结果不一致，其可能原因膈肌虽属于骨骼肌，但它像心肌一样终生反复节律性地收缩。由于膈肌本身的特性，决定 Glut－1、Glut－4 mRNA 增龄表达趋势不同于单纯骨骼肌和心肌。有研究表明随着增龄膈肌的糖酵解酶与有氧氧化酶的比值减小，说明老年膈肌的糖酵解能力减弱，而有氧活动增加［2］，无论是糖酵解还有氧活动的能量都来源于葡萄糖，而此时膈肌的 Glut－1、Glut－4 mRNA 表达升高可以增加膈肌葡萄糖的转运，从而保持膈肌持续地收缩活动，最终达到满足维持生命所需的的通气和换气功能。

总之，大鼠膈肌不同于单纯骨骼肌和心肌，Glut－1、Glut－4 mRNA 的表达具有特殊的增龄趋势。

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Age-Related Changes of Glut-1 and Glut-4 mRNA Expression in the Rat Diaphragm

CHANG Yi1，NIE Xiu－hong1﹡，CAO Ruo－jin3，CAI Yan－ning2，FENG Ming3
(1.Department of Respiratory Medicine;2.Department of Molecular Neurology，Beijing Institute of Geriatrics;3.Department of Integrative Medicine，Beijing Xuanwu Hospital，Capital University
of Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Objective The aim of this study was to investigate the age－related changes in Glut－1 and Glut－4 mRNA expression in the rat diaphragmatic muscle.Methods The expressions of Glut－1 and Glut－4 mRNA in the diaphragmatic muscle of SD rats(24 months old，n=7;3 months old，n=12)were analyzed by RT－PCR.Results In the aged groups，the expression of Glut－1 and Glut－4 mRNA in the diaphragmatic muscle was markedly higher than that in young groups.Conclusions There is a characteristic age－related tendency of Glut－1 and Glut－4 mRNA expression in the diaphragmatic muscle，different from that in the skelet al and cardiac muscles.

Diaphragm;Glucose transporter;Aging;Rat

R－33

A

1671－7856(2010)08－0015－03

2010－04－08

畅怡(1979－)，女，硕士。

聂秀红(1963－)，女，博士，主任医师，教授，研究方向:肺老化机制研究，电话:010－83198668，E－mail:xwyyhxk@126.com。