复方小檗碱结肠定位片制备工艺和体内外释药评价研究

王玉蓉，邹海艳，2，周洪伟，肖尧，马劲

(1.北京中医药大学中药学院，北京 100102;2.首都医科大学中医药学院，北京 100069)

口服结肠定位释药系统(oral colon－specific drug delivery system;OCDDS)，是指采用适当的方法，使药物经口服后避免在胃、十二指肠、空肠和回肠前端释放，运送至回盲部后发挥局部或全身治疗作用的一种新型给药系统。由于结肠的结构和生理特点，OCDDS具有独特的优势，成为近年来新型给药系统的研究热点之一。

OCDDS按照释药机理可以分为:pH依赖型、时间依赖型、压力控制型、菌群触发型等［1］。由于人体胃肠道环境复杂，影响因素较多，因此，在实际研究工作中，常将两种或两种以上的机制联合应用，以达到满意的结肠定位效果。本课题采用pH－时滞和pH－酶触两种释药模式，以盐酸小檗碱和木香提取物为研究对象，对复方小檗碱结肠定位片的制备工艺和体内外评价方法进行了研究，有关制备工艺研究已发表了相关论文［2，3］。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DP单冲压片机(北京国药龙立科技公司);岛津SPD－10Avp高效液相色谱仪;紫外检测器(日本岛津公司);万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);ZRS－8型智能药物溶出度实验仪(天津无线电厂);pHS－3C精密酸度计(上海伟业仪器厂);BY－300A型小型包衣机(上海黄海药检仪器有限公司);KQ－100DB医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 盐酸小檗碱原料(四川省什邡鸿运生物化工有限公司);木香提取物(西安奥晶科技发展有限公司);盐酸小檗碱对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号 0713－200107);Eudragit S100、Eudragit L100、PVP K30(德国BASF公司);乙基纤维素水分散体(Surelease，固含物占25%(w/w)，上海卡乐康包衣有限公司);聚乙二醇6000(PEG 6000，北京市海淀会友精细化工厂);果胶(富达果胶工业有限公司);瓜耳豆胶(北京凤礼精求商贸有限责任公司进口封装);果胶酶Pectinase、β－甘露聚糖酶Beta－Mannanase(北京博仕奥生物技术有限公司)、微晶纤维素(MCC，湖州展望药业有限公司);羧甲基淀粉钠(CMS－Na，营口奥达制药有限公司)，乙腈(色谱纯，Fisher Scientific);水(超纯水);其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 Wistar大鼠50只，雌雄兼用，体重200～250g(合格证号 SCXK(京)2006－0009，北京维通利华实验动物技术有限公司)。

2 实验方法与结果

2.1 复方小檗碱结肠定位包衣片的辅料筛选

2.1.1 时滞层包衣料的筛选

在Surelease中加入占固含物量10%的PVP，调节时滞层衣膜的水渗透性。控制肠溶聚合物增重为4%，使时滞层增重分别为4%、5%、6%，考察时滞层包衣厚度对释药速度的影响，结果见图1。

图1 不同厚度时滞层对包衣片释放度的影响

由图1可示，当时滞层增重6%(肠溶衣料增重4%)时包衣片在人工肠液中的释药时滞为174～207min，与药物进入小肠末端或升结肠的时间基本相符。

2.1.2 pH－依赖层包衣料的筛选

2.1.2.1 肠溶衣料不同比例对释药速度的影响

采用丙烯酸树脂Eudragit L10和Eudragit S100为肠溶材料，将二者按一定比例混合，调节衣膜溶解速度，以达到预期释药效果。将Eudragit L100和 Eudragit S100按1:1、1:2、1:4比例，分别配制包衣液，包衣增重为3.7%，进行释放度试验，结果见图2。当Eudragit L10与Eudragit S100的比例为1:2时，盐酸小檗碱在进入小肠后0.5h开始快速溶出，符合本实验的设计要求。

图2 Eudragit L与Eudragit S不同比例对释放度的影响

2.1.2.2 增塑剂种类对释药速度的影响

观察TEC、PEG6000和DEP三种增塑剂对药物释放的影响，结果见图3。其中以PEG 6000为增塑剂时释药速率最快，故本研究选用PEG6000为增塑剂，用量为聚合物的20%(W/W)。

图3 不同种类增塑剂对释放度的影响

2.1.3 酶触材料的筛选

2.1.3.1 酶触材料种类的筛选

考察果胶、瓜耳豆胶及果胶与瓜耳豆胶比例1:1制成的盐酸小檗碱片溶出情况，以小肠模拟介质2h突释量(%)和结肠模拟介质6h释放量(%)的topsis综合值为指标，筛选酶触材料的种类。结果见表1。

体外释药的结果表明:由果胶和瓜耳豆胶以1∶1比例制得的盐酸小檗碱片，突释现象较轻，能控制药物使其缓慢释放。

表1 酶触材料的种类对释药情况的影响

2.1.3.2 酶触材料比例的筛选

考察果胶和瓜耳豆胶比例为1∶1.5、1∶1、1.5∶1的盐酸小檗碱片溶出情况，筛选酶触材料的比例。以小肠模拟介质2h突释量和结肠模拟介质6h释放量(%)的topsis综合值为指标，结果如图4。

图4 果胶与瓜尔豆胶不同比例对释放的影响

结果表明:按不同比例制得的复合胶片，果胶用量越大，对小檗碱的控释效果越差，当瓜耳豆胶用量上升到果胶用量的1.5倍时，控释效果与1倍量无明显差异。确定果胶和瓜耳豆胶比例为1∶1。

2.2 结肠定位包衣片的制备

2.2.1 pH－时滞型包衣片的制备

将盐酸小檗碱、木香提取物及辅料按处方混合均匀，制粒并压制6mm片芯。所得片芯由内到外依次包上时滞层(增重6%)和肠溶层(增重4%)。

时滞层:量取适量Surelease包衣液，加入蒸馏水使成固含量15%，继续搅拌15min，即得时滞层包衣液。将片芯置包衣锅中，在滚动下喷入包衣液。包衣条件:包衣锅倾角45°;通入喷枪压缩空气压力为0.2～0.4MPa;喷枪口径为 1mm;转速 40r·min－1;热风温度保持在50℃。

肠溶层:按比例称取包衣料制成5%乙醇溶液，加入适量增塑剂，搅匀，即得。包衣方法与条件:除热风温度为38℃外，其他同“时滞层”项下。制得pH－时滞型包衣片。

2.2.2 pH－酶触包衣片的制备

片芯的制备:称取处方量盐酸小檗碱、木香提取物、适量酶触材料。依照等量递加法混合均匀后过60目筛，以85%乙醇为粘合剂，湿法制粒，干燥，整粒，加入0.5%硬脂酸镁，混匀，单冲压片机压制6mm片，片重0.1g，硬度4 ～5kg。

肠溶层包衣同上。

2.3 体外释放度试验

2.3.1 pH－时滞型复方片

按《中国药典》(2005版二部)附录XC溶出度测定第二法，将包衣片置于900mL溶出介质中，转速100r·min－1，温度(37 ±0.5)℃，模拟包衣片在胃肠道中的释放行为，释放介质分别为0.1mol·L－1HCl(0～2h)、pH6.8 PBS(2～5h)和pH7.6 PBS(5h～结束)，每次取样2mL(同时补加同温同体积介质 2mL)，用0.45μm微孔滤膜滤过，进样10μL，HPLC法测定，以盐酸小檗碱含量为指标，计算包衣片的累积释放度，并且绘制包衣片的累积释放曲线，评估药片的体外释药性能。结果表明，该片剂在模拟胃液中不释放，在pH6.8 PBS中累积释放10%的时间t0.1为(199.6±14.7)min，与进入回盲部的时间基本相符，基本达到了结肠定位制剂的体外释药要求(图5)。

图5 pH－时滞型复方片的体外累积释放曲线

2.3.2 pH－酶触型复方片

按《中国药典》2005版(二部)附录XC溶出度测定第二法，释放介质选择0.1mol·L－1HCl溶液为人工胃液(0～2h)，pH6.8 PBS为人工小肠液(2～5h)和pH5.8 PBS人工结肠液(含果胶酶 0.5g·L－1，β － 甘露聚糖酶0.5g·L－1;5～11h)。测定方法同上。

将包衣骨架片2～11h的溶出数据进行零级方程，一级方程，Higuchi方程拟合。结果见表2。

表2 包衣骨架片释药模型拟合

结果表明:包衣骨架片在加酶介质中从2～11h的释放状态基本符合零级方程。

2.4 HPLC含量测定方法

2.4.1 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm);流动相:乙腈 －0.05M KH2PO4(H3PO4调 pH 3.0)(60∶40)，流速 1.0mL·min－1，检测波长345nm。

2.4.2 标准曲线 取盐酸小檗碱对照品5mg，精密称定，用蒸馏水稀释定容于25mL容量瓶中，作为浓储备液。精密量取储备液适量，加蒸馏水稀释成浓度分别为 2.07、4.14、8.28、20.70、41.40μg·mL－1的标准溶液，进样10μL，于345nm处测定峰面积。以峰面积(A)对进样量(x)进行回归，得标准曲线方程:A=3551340.17x+37796.15，r=0.9995。表明盐酸小檗碱进样量在0.0207～0.414μg内线性关系良好。

2.4.3 方法学考察(略)

2.5 体内定位释药评价研究

2.5.1 复方小檗碱结肠定位小片的制备 按上述工艺分别制备了pH－时滞和pH－酶触复方小檗碱结肠定位小片(Φ3mm)，调整了包衣增重，体外释放度试验符合相关要求。

2.5.2 动物实验方法 将自制的结肠定位片(Φ3mm)分别经特制的灌胃器给大鼠灌胃，以考察药物在大鼠胃肠道中的释药情况。每组大鼠25只，雌雄兼用。大鼠给药前禁食24h，给药前30min禁水。每组大鼠再随机分为5组，每组5只，灌胃给药，每只大鼠给药1片。分别于给药后2、4、5、6、8h处死，分取胃肠道(胃、小肠近端、小肠远端、盲肠、结肠)，用人工胃肠液少量多次冲洗其内容物，并定容至50mL后超声10min，4000 r·min－1离心 15min，精密吸取胃肠道内容物上清液0.3 mL，加入3倍量甲醇，涡旋混匀，6000r·min－1离心 5min，取上清液用 0.45μm 微孔滤膜滤过，HPLC测定，进样10μL。将各肠道内盐酸小檗碱分布量进行平均处理，结果分别见表3和表4。

表3 pH－时滞型复方小檗碱片在大鼠胃肠道内的分布情况(±s，n=3)

表3 pH－时滞型复方小檗碱片在大鼠胃肠道内的分布情况(±s，n=3)

T(h)胃(mg)小肠近端(mg)小肠远端(mg)盲肠(mg) 结肠(mg)2 － － 0.10±0.00 － －4 － － 2.38±0.08 － －5 － － 1.54±0.82 1.56±0.83 －6 － － 0.33±0.35 1.53±0.83 －8 － － － 1.40±0.83 0.37±0.51均值 － －1.231.490.37

表4 pH－酶触型复方小檗碱片在大鼠胃肠道内的分布情况(±s，n=3)

表4 pH－酶触型复方小檗碱片在大鼠胃肠道内的分布情况(±s，n=3)

T(h)胃(mg)小肠近端(mg)小肠远端(mg)盲肠(mg) 结肠(mg)2 － － 0.44±0.24 － －4 － － 0.77±0.6 0.31±0 －5 － － 0.73±0.26 0.90±0.73 －6 － － 0.27±0.25 1.53±1.71 －8 － － 0.08±0 0.72±0.46 2.18±2.78均值 － －0.460.872.18

结果表明，两种类型的复方小檗碱结肠定位片在胃及小肠前端均不释药，当药片推进到小肠远端时，开始释放药物，在盲肠及结肠处大量释放盐酸小檗碱。

3 讨论

3.1 关于时滞层辅料的选择 pH－时滞型释药模式的设计基于pH依赖与时间双重控制原理，基本思路为将片芯由内到外依次包上时滞层和肠溶衣层。Aquacoat和Surelease包衣料是目前上市的两个乙基纤维素(EC)水分散体品种，常用于缓控释制剂的包衣。Surelease在包衣过程就可以实现膜愈合完全，不需要包衣后再进行热处理，而Aquacoat在包衣结束后还需经过一段时间的热处理，才能使膜愈合完全。因此本实验选择Surelease为时滞层包衣料。

3.2 关于酶触型辅料的选择 目前用于菌群触发型结肠定位给药的辅料主要有两大类:一类是合成的聚合物，另一类是天然多糖类。由于多糖类物质易于化学和生物改性，具有价廉、来源广泛、稳定性高、安全、无毒以及易于形成凝胶等优良特性，已成为很有发展潜力的靶向药物传递系统载体［4］。本实验混合使用了采用果胶和瓜尓豆胶混合胶，由于果胶的水溶性较高，单独使用无法有效控制药物在小肠的释放;而瓜耳豆胶属于黏度大的天然胶，能形成有效的凝胶层控制药物释放，但酶解速度较慢。当果胶与瓜耳豆胶以不同比例复合使用时，药物释放速率可达到相关要求。

3.2 关于动物的选择 很多OCDDS的体内研究选择犬作动物模型，但犬的胃肠道生理特点与人体相差较大［5］，此外小檗碱在犬体内吸收差，较大剂量有毒副作用［6］。大鼠是目前公认的与人体消化道的解剖结构、生理特点、生化环境相似、廉价的动物，因此本实验选择大鼠进行体内研究。

3.3 关于小片的制备 本实验选择与人体胃肠道特点较接近的大鼠为受试动物，为便于口服给药，根据大片的制备原理和方法制备Ф3mm的小片，并制作了特制的动物灌胃器，对pH－时滞型结肠定位片的体内释药行为进行了初步考察，同时也曾对pH－酶触结肠定位片进行大鼠体内定位的初步评价，也已表明两种口服包衣片均在小肠远端、盲肠和结肠部位释药，具有一定的适用性。为保证结肠定位小片与大片有相近的释药性能，本实验以体外释放试验为基础对小片的包衣增重进行了考察，由大片原工艺拟制小片的包衣增重规律还需进一步验证，有关体内的释药特性也有待进一步研究。

［1］ 任飞亮，裴元英.口服结肠定位释药系统的研究进展［J］.中国药学杂志，2005，40(17):1288 －1291.

［2］ 马劲，王玉蓉，肖尧.薄膜包衣法制备中药复方结肠定位定时片［J］.北京中医药大学学报，2008，31(10):708 －711.

［3］ 肖尧，王玉蓉，马劲，等.盐酸小檗碱酶触型结肠定位片的制备［J］.北京中医药大学学报，2008，31(12):847 －850.

［4］ Sinha VR，Kumria R.Polysaccharides in colon specific drug delivery［J］.Int J Pharm，2001，224(1):19 －38.

［5］ Kararli T T.Comparison of the gastrointestinal anatomy，physiology，and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals［J］.Biopharm Drug Dispos，1995，16(5):351 －380.

［6］ 齐美玲，吴德政.结肠给药系统的设计及体内评价［J］.中国临床药理学杂志，2000，16(2):150 －154.