电针对模型大鼠海马CA1区Aβ的阳性细胞表达和脑内SOD活性的影响

赵凤云，关珊珊，张鹏，姜国华

(1.黑龙江省康复医院，黑龙江 哈尔滨 150018;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)是神经系统变性疾病，以老年人为多发，是痴呆最常见的病因。以老年斑、神经元纤维缠结、海马椎体细胞颗粒空泡变性和神经元缺失为典型病理特征，是伴随老化而出现认知功能障碍为主的疾患。针灸对痴呆具有一定的疗效，对老年痴呆患者的智能提高(改善学习记忆功能障碍)及临床症状改善均有明显的作用［1～3］。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

4月龄Wistar大鼠60只(黑龙江中医药大学实验动物中心提供)，健康清洁级，体重220～250g，链脲霉素(STZ)、丙二醛、超氧化物歧化酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Aβ免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物分组、造模及行为学测试

将Wistar大鼠在实验室适应性饲养1w，然后用Morris水迷宫筛选出智力正常的60只大鼠，随机分成空白组12只、模型对照组12只、模型组12只、西药组12只和电针组12只。模型组、西药组和电针组的大鼠经10%水合氯醛(3mL·kg－1)腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上。常规消毒头顶部皮肤，正中矢状切口，分离骨膜后用锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜，参照大鼠脑立体定位图谱［1］定位侧脑室:前囟后0.8mm，中线旁开1.5mm，深3.8mm。用微量注射器在每侧侧脑室各注射链脲霉素(STZ)10μL(注射前将STZ 溶于生理盐水，浓度为 10%)［5，6］，缓慢进针，匀速给药，10min注完，使其充分浸润局部组织，缓慢拔出微量注射器，第3天重复注射，剂量同前。正常组不予处置，模型对照组操作同前，以等量生理盐水替代STZ。所有术后大鼠均肌注青霉素，每只每天40万单位，常规饲养。水迷宫行为学测试分别在术前、术后及治疗后进行。①定位航行试验:历时5d，每天(上午7点30至下午16点)4次水迷宫测试，将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录其在120s内找到平台并爬上平台的时间，即潜伏期。如果大鼠在120s内不能找到平台，则由实验者用手牵引其至平台。第1d让大鼠在平台上停留20s，第2d停留15s，第3d停留10s，第4天停留5s。②空间探索实验:第5d去除平台，任选一入水点，将大鼠放入水池中，记录其在120s内跨过原平台所在位置的时间。

1.3 治疗及取材

正常组、模型对照组、模型组常规饲养。西药组给与氢溴酸加兰他敏，剂量为0.5～1mg·(kg·d)－1。电针组针刺治疗，根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的《动物针灸穴位图谱》，用0.25mm×25mm毫针针刺百会穴，平刺约2.5mm;大椎穴，直刺约4mm;双侧太溪穴，直刺进针3mm;双侧肾俞穴，直刺进针5mm;双侧足三里穴，直刺进针4mm。其中百会穴、大椎穴连接KWD－808Ⅱ型全能脉冲电疗仪，频率为30Hz，电压为2V，强度以肢体轻微抖动为度;余穴间歇5min捻转1次，平补平泻，每日1次，时间30min，7d为1疗程，间歇1天，治疗4个疗程后进行行为学测试。水迷宫测试完毕后，第2d每组随机选取6只，用10%水合氯醛(4mL·kg－1)腹腔麻醉，麻醉后立即开胸暴露心脏，左心室插管，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水至肝脏颜色变白，改灌4%的多聚甲醛，快速灌注，当出现下肢抽动时，缓慢灌注30min，至肝脏变硬，四肢、尾均僵硬后停灌。取脑，放入4%的多聚甲醛溶液中固定过夜，进行石蜡包埋，HE染色，免疫组织化学染色。再将每组剩余大鼠断颈处死取全脑，取一侧脑组织，去除软脑膜血管、脑干及小脑，用冰生理盐水冲洗血液后，滤纸拭干，称重，加入9倍冷生理盐水，电动匀浆机中研磨成10%匀浆，之后以3000r·min－1的速度离心15min，取上清液，按照试剂盒说明进行生化指标的检测。

1.4 图像分析及统计方法

阳性细胞数的计算:取每组大鼠脑组织切片12张，每张切片于海马区随机选取5个区域，在400倍显微镜下计算此区域内的免疫组化染色为棕色的Aβ阳性细胞数。由两名人员独立观察最后取平均值，结果以均数±标准差(±s)表示。计算公式:

图像采用Image－Proplus5.0软件进行图像分析。各组实验数据采用统计程序软件SPSS 17.0进行运算，采用t检验，用(±s)表示。

2 结果

2.1 海马CA1区Aβ蛋白表达

表1显示，正常组、模型对照组CA1区Aβ蛋白有较低表达，模型组CA1区Aβ蛋白表达水平显著升高，治疗后西药组、电针组与模型组比较有极显著性差异(P<0.01)。

表1 各组海马CA1区Aβ蛋白表达阳性细胞数(±s)(个·mm－2)

表1 各组海马CA1区Aβ蛋白表达阳性细胞数(±s)(个·mm－2)

注:与模型组比较，*P<0.01。

组别 n 表达阳性细胞数正常组 12 10.87±3.15*模型对照组 12 11.09±3.28*模型组 12 25.31±2.46西药组 12 18.52±2.63*电针组 12 17.94±2.70*

2.2 电针对AD大鼠脑组织内MDA含量和SOD活性的影响 见表2，图1。

图1显示:模型组与正常组、模型对照组比较，大鼠脑组织内MDA含量明显升高(P<0.01);电针组、西药组与模型组比较，MDA含量明显降低(P<0.01);模型组与正常组、模型对照组比较，SOD活性明显降低(P<0.01);电针组、西药组与模型组比较，SOD活性明显升高(P<0.01)，均有极显著性差异。以上说明电针可以降低AD大鼠脑组织内MDA含量，而使SOD活性增强。

表2 各组大鼠脑组织内MDA含量和SOD活性(±s)

表2 各组大鼠脑组织内MDA含量和SOD活性(±s)

注:与模型组比较，*P<0.01;与正常组、模型对照组比较，#P<0.01;与西药组比较，▲P>0.05。

组别 n MDA(nmol·mgprot－1) SOD(NU·mgprot－1)11 217.52±15.07 204.35±11.18模型对照组 10 219.73±14.87 201.51±12.36模型组 10 310.22±5.42# 121.25±8.27#西药组 9 242.47±9.65* 171.31±7.71*电针组 10 268.36±11.09*▲ 168.58±10.06正常组*▲

图1 各组大鼠脑组织内MDA含量和SOD活性比较

3 讨论

AD最典型的病理改变是老年斑，而老年斑主要成分就是Aβ。聚集状态的Aβ具有长期的稳定性，所以一旦发生聚集，很快就形成极难溶解的沉淀，在神经细胞内沉积下来。沉积的Aβ与凋亡细胞在脑内如基底核、海马、新皮层等逐渐累积，进而导致典型的老年斑。纤维状的Aβ产生毒性作用，导致神经元细胞的死亡，从而使AD患者出现认知功能减退与记忆碍障等痴呆症状。脂质过氧化的最终产物如MDA的细胞毒性作用，是导致AD神经元变性坏死的重要原因。SOD能够阻滞由于大量过氧化氢蓄积所导致的神经元凋亡的发生，对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要的作用，SOD是体内重要的自由基清除酶，能促使超氧阴离子氧化为过氧化氢，保护细胞免受损伤，衰老机体SOD活性减弱，抗氧化剂减少，自由基损伤因素增加。实验结果显示，模型组大鼠与正常组和模型对照组对比，可见到较多的Aβ沉积，其脑内Aβ阳性神经细胞数明显高于正常组和模型对照组。电针治疗后，电针组大鼠Aβ的阳性细胞表达明显下降;模型组与正常组、模型对照组比较，大鼠脑组织内MDA含量明显升高;电针组、西药组与模型组比较，MDA含量明显降低;模型组与正常组、模型对照组比较，SOD活性明显降低(P<0.01);电针组、西药组与模型组比较，SOD活性明显升高(P<0.01)，均有极显著性差异。根据阿尔茨海默病临床表现，在中医学中将其归属为“痴呆”、“健忘”、“善忘”、“呆病”、“郁证”，“癫疾”等病症范畴，针刺治疗AD的原则是补肾益髓、醒神开窍。补肾益髓以治其本，醒神开窍以治其标。在上述治疗原则的指导下，选取百会、大椎、肾俞、太溪和足三里穴。百会穴为督脉和足太阳膀胱经的交会穴，具醒神开窍之功，为治疗老年性痴呆的主要穴位;肾俞为足太阳膀胱经穴，培补肾气;太溪为足少阴肾经穴，补肾益精，二者为临床补肾要穴，常用于失眠，健忘及其它神志及精神疾患;大椎出自《素问·气府》，属督脉经穴位，是手足六阳经的交会穴，为“诸阳之会”，可通调诸经，增强各脏腑经络，促使阴阳平衡;足三里为足阳明胃经的合穴，是传统保健要穴，且在《素问·玉机真脏论》指出:“五脏者，皆禀气于胃，胃者，五脏之本也”，故而分别用来补先天之本和后天之本。诸穴相配，达到补肾益髓、醒神开窍、标本同治的目的。本实验的结果表明，电针能够抑制Aβ在脑内过度沉积，降低Aβ在脑内的表达，降低脑组织内MDA含量，而使SOD活性增强，从而改善了大鼠学习记忆功能。从实验角度验证了电针对AD的治疗效果。

［1］ 陈水灿.古代针灸益智临床经验节要［J］.中国针灸，1997，17(5):312.

［2］ 王惠仙.针灸中药并用治疗老年性痴呆52例疗效观察［J］.中国针灸，1998，18(12):735.

［3］ 刘会安.化浊益智针法治疗血管性痴呆的临床疗效观察及机理研究［J］.中国针灸，1997，17(9):52.

［4］ 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.第1版，北京:人民卫生出版社，1994.

［5］ Veerendra Kumur M H，Gupta Y K.Effect of centella Asiatica on cognition and oxidative stress in an intracerebroventricular streptozotocin model of Alzheimer＇s disease in rats［J］.Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology，2003(30):336 －342.

［6］ Sharma M，Gupta Y K.Effect of chronic treatment of melatonin on learning，memory and oxidative deficiencies induced by intracerebroventricular streptozotocin in rats［J］.Pharmacology，Biochemistry and Behavior，2001(70):325 － 331.

［7］ 毛雪璇，皮荣标.Morris水迷宫实验影响因素的研究进展［J］.中国行为医学科学，2008(17):853－855.