果子狸源呼肠孤病毒MPC/04株全基因组序列测定与分析

邵昱昊，韩宗玺，李慧昕，孔宪刚，刘胜旺

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001）

果子狸源呼肠孤病毒MPC/04株全基因组序列测定与分析

邵昱昊，韩宗玺，李慧昕，孔宪刚，刘胜旺*

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001）

为获得果子狸源呼肠孤病毒(MRV）Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04）株的全基因序列，本研究根据GenBank中登录的哺乳动物MRV基因序列设计了22对引物，运用RT-PCR技术对该毒株的各个基因片段进行了扩增和同源性分析，并绘制系统发育进化树。结果显示该毒株L1、L2、M1和S3基因核苷酸序列与SARS病人体内分离到的SARS病毒T2/BYD1/human/Song/2006(T2S）株同源性较高，该病毒株L3、M2、M3、S1、S2和S4基因核苷酸序列与病猪体内分离到的MRV株SC-A/pig/Zeng/2006(SC-A）同源性较高，系统发育进化树同样表明各个病毒株的不同基因节段均具有不同的进化过程，推测MRV不同病毒株之间存在重配现象。通过MPC/04株S1基因同源性分析和核苷酸系统发育进化树分析，表明该病毒株S1基因与MRV血清3型的S1基因同源性较高，而与其它血清型的同源性较低，因此初步判断该病毒株血清型为血清3型。

呼肠孤病毒；基因组；序列分析

哺乳动物呼肠孤病毒(Mammalian orthoreovirus，MRV）是双链RNA病毒，无囊膜，属呼肠孤病毒科(Reoviridae），正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus）。MRV基因组由10条线性dsRNA组成，分别为3个大的基因节段 L1、L2、L3，3个中的基因节段 M1、M2、M3和4个小的基因节段S1、S2、S3、S4。10个基因节段分别编码11种蛋白，包括8种结构蛋白及3种非结构蛋白[1]。MRV共存在4个血清型。其代表株分别为血清1型Lang株(T1L）、血清2型Jone株(T2J）、血清 3型 Dear株(T3D）和血清 4型Ndelle病毒(NDEV）[2]。MRV的宿主范围非常广泛，几乎所有哺乳动物的体内均能检测出MRV的抗体。MRV可引起动物严重呼吸窘迫综合征和肺纤维化[3-4]，在患脑膜炎的儿童和SARS病人体内均分离得到MRV[5-6]。到目前为止MRV的致病作用尚不明确。

本实验对1株从野生果子狸分离到的MRV株Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04）株的全基因组进行了测定与分析。同时根据S1基因在病毒血清型分型中的作用，通过S1基因的序列分析，初步确认了该毒株的血清型，为今后MRV血清型分型及MRV基因组结构与功能研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 主要实验材料及引物 感受态细胞DH5α和Vero-E6细胞由本实验室保存；MEM培养基购自Gibco公司；pMD18-T、鼠源反转录试剂盒购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Gibco公司；DNA柱式凝胶回收试剂盒及病毒提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。根据GenBank中登录的MRV序列设计22对引物，引物序列见表1。

1.2 病毒RNA提取及基因的扩增、克隆与测定用TRIzol RNA试剂提取病毒基因组RNA。采用RT-PCR方法对其10个基因完整或分段扩增，将PCR产物回收，连接于pMD18-T载体中。转化感受态细胞DH5α中，提取质粒，经PCR鉴定，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

1.3 MPC/04株各基因片段序列分析 将MPC/04株各基因ORF序列与TIL、T2J、T3D、T2S(BYD1）、SC-A株全部基因片段序列和血清4型NDEV的5个基因序列进行同源性分析，绘制氨基酸系统进化发育树，分析各病毒株之间的系统发育关系。

1.4 血清型分析 针对S1基因保守区和全基因序列的比对分析，确认病毒的血清型[11]。将MPC/04株S1基因序列，与GenBank中登录的同源性较高的病毒基因序列进行比对，选取3个血清型的代表株，使用MEGA4绘制系统进化树，进行同源性分析，分析病毒株之间的系统发育关系，用以确定该病毒株的血清型。

2 结果与讨论

2.1 病毒基因组核苷酸序列 MPC/04株核苷酸序列已录入 GenBank(GQ468266～GQ468275）。L1、L2、L3、M1、M2、M3、S1、S2、S3 和 S4 的 ORF大小分别为3 804 bp、3 870 bp、3 828 bp、2 211 bp、2 127 bp、2 166 bp、1 368 bp、1 257 bp、1 101 bp和1 098 bp。

2.2 MPC/04株病毒基因组分析 MPC/04同源性分析结果见表2。MPC/04株的L1、L2、M1和M3基因节段与T2S(BYD1）株的同位基因核苷酸同源性最高。L3、M2、M3、S1、S2和S4与SC-A株的同位基因同源性最高。系统发育进化树(图1）分析表明，MPC/04株的各个片段均有不同的进化史，这与以往的报道相一致。L1基因的氨基酸同源性分析表明其与T2S同源性最高为98.9%，与T1L和SC-A同源性为98%，与T2J同源性最低为91.7%；从图1-A可得出L1进化与血清型无关的结论，这进一步证明了Leary等的报道[7]。

2.3 MPC/04株病毒血清型分析 不同病毒株S1基因之间的同源性分析表明，MPC/04株同T3D和SC-A株同源性高，核苷酸同源性分别为85.5%和93.3%，氨基酸同源性分别为91.6%和94.3%(表2）。而该病毒株S1基因与T1L、T2J和T2S同位基因同源性均较低，氨基酸同源性最高也仅为26.7%(图1-G）。T3D、SC-A和MPC/04均在同一进化分支上，而其它病毒株则在不同的分支上。图2表明，在该系统发育进化树中，同一血清型MRV均位于同一进化分支中。相关文献报道[11-12]，MRV的S1基因可分为A、B、C、D、E、F 6个亚型，其中A亚型为MRV1型，B亚型为MRV2型，其它几个亚型均为血清3型。针对MPC/04株和国内在猪体内分离到的SC-A株的S1基因，与以往报道的S1基因比较显示处于相对的不同分支上，表明MRV MPC/04株血清型应为MRV血清3型。

MRV血清型的鉴定主要依据血清学试验以及血凝抑制试验来确定，但本实验采用分子生物学方法对MRV的血清型进行分析。Decaro等在狗体内分离到一株MRV[11]，并根据S1基因不同血清型保守区的不同对其分离株进行了血清型分型。本研究根据获得的MPC/04株S1基因序列与MRV现有病毒株的S1进行比对分析，也表明MPC/04株血清型为MRV血清3型。

表1 扩增用RT-PCR引物Table 1 Primer for RT-PCR

表2 MPC株与其它MRV株全基因组序列同源性比较Table 2 Percentages of nucleotide identity of the strain MPC/04 with the(almost）completely sequenced MRV strains

根据MPC/04全基因组系统发育进化树表明，MRV各基因节段具有独立的拓朴结构，各基因组节段的分子进化过程是相对彼此独立的，与Chappel等对S2基因的遗传多样性的分析结果相一致[13]，证明病毒基因组重配现象的存在。MRV的宿主范围较广，不仅能引起鼠和灵长类呼吸系统、消化系统和神经系统疾病，还可引起人的呼吸道和肠道疾病，由于MRV明显缺乏种间屏障，所以存在由动物传播给人类的潜在可能性，因此获得MPC/04全基因序列有助于对该病毒的遗传演化史进行分析，也有助于研究MRV是否存在公共卫生学方面的意义。本研究是国内外首次获得果子狸源MRV的全基因组序列，该序列的测定为研究MRV的流行规律和生物学背景提供了资料，也为研究MRV分子变异致病机理奠定了基础。

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Whole genome sequencing of Mammalian orthoreovirus MPC/04 strain from Masked Civet Cats

SHAO Yu-hao,HAN Zong-xi,LI Hui-xin,KONG Xian-gang,LIU Sheng-wang*
(Division of Avian Infectious Diseases,State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

The whole genome of Mammalian orthoreovirus(MRV）Masked Palm Civet/China/Liu/2004(MPC/04）strain was sequenced using 22 pairs of specific primers derived from the published sequences of MRV.Nucleotide sequence analysis showed that the segment L1,L2,M1 and S3 of the genome shared the highest identity with those of strain T2/BYD1/human/Song/2006(T2S）isolated from a SARS patient,and the segment L3,M2,M3,S1,S2 and S4 had the highest homology with those of strain SC-A/pig/Zeng/2006(SC-A）isolated from pig.Phylogenetic tree analysis showed that each segment had an independent evolutionary path,indicating that reassortment was evident during evolution.Based on the S1 sequence and phylogenetic analysis,it was concluded that the MPC/04 strain belong to the MRV serotype 3.

Mammalian orthoreovirus;genome;sequence analysis

S852.61

A

1008-0589(2010）08-0627-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.12

*Correspondingauthor

2009-08-18

国家重点基础研究发展计划(“973”计划）(2005CB522905）

邵昱昊(1976-），男，黑龙江海伦人，硕士，助理研究员，主要从事动物病毒分子生物学研究.

*通信作者：E-mail：SWLIU@hvri.ac.cn

(本文编辑：陈立群）