表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

华 涛，陶丽红，葛金英，王喜军，沈向真，步志高*

(1.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室，黑龙江哈尔滨 150001）

表达绿色荧光蛋白重组狂犬病病毒Flury-LEP的构建及其用于中和抗体检测的研究

华 涛1,2，陶丽红2，葛金英2，王喜军2，沈向真1，步志高2*

(1.南京农业大学动物医学院，江苏南京 210095；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开发实验室，黑龙江哈尔滨 150001）

为确定狂犬病病毒(RV）Flury-LEP株外源基因的插入位点及其中和抗体快速检测方法，本研究在建立了RV Flury-LEP株反向遗传操作系统的基础上，构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP）的重组LEP基因组cDNA克隆pCI-LEP-EGFP，并成功拯救出重组病毒(rLEP-EGFP）。rLEP-EGFP的生物学特性和野生型LEP(wtLEP）在NA细胞和BHK-21细胞中的生长动力学及对小鼠的致病性没有显著差异。rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次，各代次重组病毒均稳定表达EGFP。重组表达的EGFP可用于中和抗体检测，rLEP-EGFP免疫犬血清经间接免疫荧光(IFA）或荧光下直接观察检测RV中和抗体滴度，两种检测结果显示较好的相似性(p＞0.05）。本研究为研制以Flury-LEP株活载体多价疫苗奠定了基础，并为病毒中和抗体的检测提供了更为快捷的新方法。

狂犬病病毒；Flury-LEP株；EGFP；反向遗传操作；多价疫苗；病毒中和抗体

狂犬病病毒(Rabies virus，RV）为人兽共患狂犬病的病原。RV属于弹状病毒科狂犬病毒属，基因组为一条约12 000 nt负链RNA，共编码5种病毒蛋白：核衣壳蛋白(N）、磷酸化蛋白(P）、基质蛋白(M）、糖基化蛋白(G）和多聚酶(L）。在病毒的组装过程中，N蛋白与基因组RNA结合，形成核糖核蛋白体(RNP），在P蛋白与L蛋白组合形成的RNA聚合酶的参与下，启动病毒的生物合成。

自1994年Schnell等首次利用反向遗传操作系统拯救了RV的SAD B19株[1]，至今已成功拯救出的 RV SHBRV-18[2]、 Nishigahaga[3]、 Ni-CE[4]和 Evelyn-Rokitnicki-Abelset(ERA）株 等[5]。Flury-LEP 株 具有优良的免疫原性，被广泛用作人或动物的狂犬病灭活疫苗种毒株，并在中国及其他一些国家用作预防犬狂犬病的弱毒疫苗。

本研究以Flury-LEP弱毒疫苗株作为活病毒载体，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP）基因插入其G与L基因之间，拯救了表达EGFP的Flury-LEP的重组病毒(rLEP-EGFP），并通过荧光下直接观察的方法对RV中和抗体进行检测，为RV重组病毒疫苗的研发奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株及细胞 RV Flury-LEP疫苗株购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；BHK-21细胞、293T细胞和小鼠脑神经瘤细胞(NA细胞）均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 T4 DNA连接酶、限制性内切酶SphⅠ和MluⅠ均购自TaKaRa公司；PhusionTMTaqDNA聚合酶购自NEB公司；无血清培养基Opti-MEM和转染试剂LipofectamineTM2000均购自Invitrogen公司；犊牛血清购自Gibco公司；FITC标记的羊抗鼠荧光二抗购自Sigma公司；鼠抗RV的ERA株高免血清由本实验室制备。

1.3 含EGFP基因的Flury-LEP全长cDNA感染性克隆的构建 按常规方法提取Flury-LEP病毒株RNA，并将其全长基因组分为末端部分相互重叠的F1、F2和F3的3个片段(图1）进行RT-PCR扩增。并且在F1片段前加锤头状核酶(HamRz）序列、F3片段后加丁肝核酶(HdvRz）序列。cDNA片段克隆至pBluescript并经序列分析与病毒基因组RNA序列完全一致后，将3个片段依次克隆至转录载体pCI中，构建的病毒基因组转录质粒命名为pCI-LEP。设计两对引物(表1）：第一对引物B1-f和B1-PmeⅠ-r，第二对引物B2-PmeⅠ-f和B2-r，通过SOE(Gene splicing by overlap extension）PCR方法在cDNA第4 906 bp后引入PmeⅠ限制性酶切位点(GTTT AAAC），获得的PCR片段替换至pCI-LEP上的F2段，从而构建成重组基因组转录载体pCI-LEP-PmeⅠ；以EGFP-PmeⅠ-f和EGFP-PmeⅠ-r为引物，以pIRES-EGFP(Clonetech）为模板，通过 PCR，在EGFP的ORF的5'端引入PmeⅠ限制酶识别序列和LEP自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(AGAA AAAAA）及转录起始序列GS(AACATCCCT）；PCR产物经PmeⅠ酶切插入pCI-LEP-PmeⅠ，构建的表达EGFP重组基因组全长cDNA克隆命名为pCI-LEP-EGFP(图1）。N、P及L基因的开放阅读诓(ORF）cDNA分别克隆在pCAGG质粒的多克隆位点，构建成的辅助质粒分别命名为pCAGG-N、pCAGG-P和pCAGG-L。

表1 PCR扩增所用引物序列Table 1 Primers used for PCR

1.4 重组病毒的拯救及扩增 按LipofectamineTM2000转染试剂说明书的操作方法将pCI-LEP-EGFP、pCAGG-N、pCAGG-P 和 pCAGG-L 按 4∶2∶2∶1 的比例混合，转染约生长为80%的293T细胞单层，8 h后更换新鲜完全培养基继续培养至72 h，将培养液及细胞混合物接种BHK-21细胞；48 h后用荧光显微镜观察EGFP在感染细胞内的表达情况，将拯救病毒命名为rLEP-EGFP。将获救的病毒在BHK-21细胞上进行扩增，制备种毒，-70℃冻存，用于对救获病毒的进一步滴定及生物学特性分析。

1.5 病毒的滴定 rLEP-EGFP感染细胞上清液作10倍倍比稀释，以100 μL接种于BHK-21单层细胞或NA细胞，37℃吸附1 h后洗涤2次，加入新鲜培养液。48 h后用荧光显微镜直接观察，病毒滴度用病灶形成单位(FFU）计数表示。

1.6 生长动力学曲线的测定 为测定病毒生长动力学曲线，以M.O.I.为0.01分别感染单层NA细胞和BHK-21细胞。感作1 h后用，用PBS洗2次后分别加0.2%胎牛血清的MEM或2%DMEM于37℃培养。分别于接种后24 h、72 h和120 h取细胞培养液上清，在NA细胞和BHK-21细胞上测定滴度，绘制病毒生长动力学曲线。

1.7 LD50的测定 将rLEP-EGFP和wtLEP用PBS作10倍倍比稀释至10-7,将10-4～10-7各稀释度分别取30 μL脑内接种5只5周龄～6周龄的BALB/c雌性小鼠。连续观察21 d，记录每组小鼠的平均体重变化和死亡情况。利用Reed-Muench法计算小鼠半数致死量(LD50）。

1.8 血清样品 5条比格犬(No.1～No.5）肌肉注射免疫106FFU的弱毒活疫苗Flury-LEP，5条比格犬(No.6～No.10）肌肉注射免疫107FFU的灭活Flury-LEP，均于3周后采血并分离血清。

1.9 中和试验 血清样品首先56℃水浴处理30 min灭活，随后连续20倍至1 280倍倍比稀释，同时设阴、阳性血清对照。将稀释的血清与含10 000个FFU的Flury-LEP病毒或rLEP-EGFP病毒等体积混合，37℃孵育1 h，然后取100 μL加到过夜生长的24孔BHK-21细胞中，每个样品做3个重复。

1.10 间接免疫荧光检测(IFA） Flury-LEP感染后48 h进行IFA，以鼠抗RV的ERA株高免血清为一抗、荧光素(FITC）标记的羊抗鼠IgG(Sigma）为二抗进行孵育后，用荧光显微镜观察结果。rLEP-EGFP感染后48 h用荧光显微镜直接观察EGFP在感染细胞的表达情况，省去了荧光抗体检测步骤。

2 结果

2.1 重组Flury-LEP株基因组cDNA的构建 利用相邻重叠部分的限制酶切位点将基因组cDNA片段F1、F2和F3逐一克隆至转录载体pCI中，克隆在CMV启动子下游，两个核酶之间的全长cDNA可以在真核细胞RNA聚合酶的作用下得到转录，并且由于核酶的自身催化功能，可以保证转录产物的3'末端与病毒基因组精确一致。在此基础上，进一步利用基因组cDNA 4 906处引入的PmeⅠ位点，插入5'端引入LEP L聚合酶特异的转录调控序列GE和GS的EGFP基因，构建成表达GFP的重组LEP cDNA感染性克隆pCI-LEP-EGFP。

2.2 从cDNA克隆救获感染性重组LEP 将pCILEP-EGFP与3个辅助质粒 pCAGG-N、pCAGG-P、pCAGG-L共转染293T细胞。拯救的重组病毒感染BHK-21，48 h在荧光显微镜下可观察到自发绿色荧光(图2）。结果表明，采用反向遗传操作技术成功地拯救了表达外源基因EGFP的感染性重组病毒rLEP-EGFP。

2.3 重组病毒的生物学特性

2.3.1 生长动力学曲线wtLEP在非神经元细胞BHK-21中24 h、72 h和120 h生长滴度(FFU/mL）为：3×104、6×107和 7×107，在神经元细胞 NA细胞为：2×104、1×107和 7×107；rLEP-EGFP在BHK-21细胞同样时间点的生长滴度为：1×104、1×106和 2×107，在 NA 细胞为：4×103、4×106和 2×107。wtLEP和 rLEP-EGFP在 NA和 BHK-21上的生长动力学曲线显示(图3），rLEP-EGFP在两种细胞上的的生长性能与wtLEP没有显著差异，这表明从重组基因组全长cDNA拯救出的rLEP-EGFP的生长特性与wtLEP是一致的，EGFP基因的插入并没有影响病毒的增殖特性。

2.3.2 对小鼠的致病性为了确定rLEP-EGFP对小鼠的致病性，每只小鼠脑内接种病毒105FFU/30 μL。感染rLEP-EGFP的小鼠表现出麻痹、兴奋、体重减轻等中枢神经系统疾病的临床症状，所有的小鼠在11 d内全部死亡。rLEP-EGFP的LD50与wtLEP进行比较，分别为6.3个FFU和8.8个FFU，结果表明这两个毒株对小鼠的致病性没有显著差异。

2.3.3 LEP-GFP外源报告基因的稳定表达将rLEP-EGFP在BHK-21细胞中连续传代9次，各代次细胞上清分别10倍倍比稀释100 μL体积接种24孔板培养BHK-21细胞，48 h后荧光显微镜直接观察结果，各代次EGFP均能稳定表达。根据镜下表达绿色荧光蛋白的病灶数量，确定各代次rLEPEGFP每毫升FFU介于104～107之间(图4）。各代分别为 F1：4×104，F2：8×105，F3：2×107，F4：1×107，F5:8×106，F6：3×107，F7：2×107，F8：1×107，F9：4×107，F10：2×107。

2.4 rFlury-LEP的特异性中和抗体检测 分别以Flury-LEP株和rLEP-EGFP株作为接种毒株检测比格犬一次免疫血清中和抗体，第一组比格犬免疫弱毒疫苗，第二组比格犬免疫灭活疫苗，共检测10份血清。以Flury-LEP株为接种毒株时需通过IFA检测，而以rLEP-EGFP株作为接种毒株时可直接在荧光显微镜下观察即可。结果表明，两组血清由两种方法检测的中和抗体滴度(表2）差异无统计学意义(p＞0.05）。

表2 两种不同方法检测犬病毒中和抗体滴度Table 2 Virus-neutralizing antibodied titers of canine sera determined by different methods

3 讨论

本研究构建表达绿色荧光蛋白pCI-LEP-EGFP感染性克隆，并救获重组病毒rLEP-EGFP。1996年，Mebatsion等首先发现无论是将CAT基因插入非编码区还是置换该区域，拯救的RV都能高效表达CAT[6]，其生物学特性与亲本SAD L16相似。本实验也证实重组病毒rLEP-EGFP的遗传稳定性，连续9次传代后不仅仍表达外源蛋白且能维持高滴度，与亲本病毒相似。小鼠颅内注射rLEP-EGFP和wtLEP，rLEP-EGFP致病性与亲本病毒相似。本实验采用CMV启动子，结果显示CMV进行拯救可适用于更多的细胞系，经过适宜的细胞系传代所获得的病毒滴度更高，这与Inoue等的结果相似[7]。

针对RV的病毒中和抗体(VNA）在保护动物免于狂犬病中起着至关重要的作用，RFFIT(The rapid fluorescent focus inhibition test）和FVAN(Fluorescent antibody virus neutralization）被广泛用于体外检测VNA，但是这两种方法费用高且耗时。Khawplod[8]等在RFFIT检测人、马、犬血清的VNA试验中，用表达GFP重组rHEP-GFP毒株代替传统的接种毒株CVS直接检测，与传统的RFFIT相比较其检测结果显示很好的一致性。本实验利用表达绿色荧光蛋白的重组病毒rLEP-EGFP作为接种病毒株，可在荧光显微镜下直接观察细胞感染情况。与常用的抗体滴度检测方法IFA作比较，使用rLEP-EGFP为检测抗原来滴定病毒中和抗体滴度，其结果同样显示了很好的相似性，该方法方便、经济且结果可靠。在后续的实验中，采用犬的国标标准血清作对照，IFA用CVS作为接种毒株,并与WHO推荐的RFFIT或OIE推荐的FVAN作对比，加大我国临床应用的各种狂犬疫苗免疫犬血清的获得量，这样rLEP-EGFP直接荧光检测法所获得的数据更加能对临床具有指导意义。

Faber等以TNF为外源基因插入到缺失φ基因的SAD B19的G-L之间，结果发现重组病毒在小鼠脑内传播速度减慢[9]。Hosokawa-Muto等在构建的弱毒株rRC-HL反向遗传学系统基础上构建了双G蛋白R(NPMGGL）株，该弱毒株感染的细胞不但病毒滴度增加而且G蛋白表达量增加了1.5倍[10]，表明免疫效果比rRC-HL株更好。该病毒株与Dietzschold等构建的双G株SPBNGA-GA相比毒力更弱[11]。活苗的免疫原性与致病力往往相矛盾的，需要一种方法解决这种矛盾，基因缺失疫苗应运而生。2005年，Ito等构建了一株缺失M基因的RC-HL病毒(RC-HL△M）[12]，这种缺陷病毒不能产生子代病毒，只可以在组成性表达MP的BHK细胞中增殖，但MP单独表达对细胞系是有害的。Morimoto等构建了缺失P基因Flury HEP株[13]，在致病性和免疫效果上获得了相似的结果。2008年，Cenna等构建了缺失P基因双表达GP的SPBN-△P-RVG[14]，103FFU肌内免疫即可达到达到60%～100%对致死剂量CVS肌肉攻毒保护；SPBN-△P载体肌肉注射B细胞和T细胞缺失小鼠无致病性。SPBN-△P-RVG基因缺失株的建立为狂犬病新型安全疫苗和载体研制提供了新的思路。

本研究构建了表达绿色荧光蛋白重组病毒，该病毒可用于方便快速地测定病毒中和抗体，同时也为构建表达犬瘟热等其它重要病原保护性免疫原的重组病毒，研制出可同时预防狂犬病及犬瘟热等其它疫病的重组二联活载体疫苗奠定了基础。

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Construction of a recombinant rabies virus expressing enhanced green fluorescent protein for the detection of virus neutralization antibodies

HUA Tao1,2,TAO Li-hong2,GE Jin-ying2,WANG Xi-jun2,SHEN Xiang-zhen1,BU Zhi-gao2*

(1.College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Key Laboratory of Veterinary Public Health of Ministry of Agricultural,Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China）

To construct the recombinant rabies virus and develop a convenient method for virus neutralization antibodies(VNA）detection,a recombinant rabies virus rLEP-EGFP expressing enhanced green fluorescent protein(EGFP）was rescued based on infectious clone of rabies virus Flury-LEP strain.The biology characters of rLEP-EGFP were similar to that of the wild type LEP strain in respect of the growth dynamics in both NA cells and BHK-21 cells,and the pathogenicity in BALB/c mice.The EGFP expression of rLEP-EGFP was stable for at least nine passages in BHK-21 cells.The rLEP-EGFP could be used for detection of neutralization antibody in canine serum,and the results were as same as that of indirect immunofluorescence assay(p>0.05）.This LEP-EGFP system provided an useful platform for development of novel polyvalent vaccine,and a convenient and economical method for VNA detection.

book=582,ebook=65

Rabies virus;Flury-LEP;EGFP;Reverse genetic;polyvalent vaccine;virus neutralization antibodies

S852.65

A

1008-0589(2010）08-0581-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.01

*Correspondingauthor

2009-10-16

国家“973”计划(2005CB523200）

华 涛(1981-），男，江苏连云港人，硕士研究生，主要从事动物分子病毒学研究.

*通信作者：E-mail：zgb@hvri.ac.cn

(本文编辑：赵晓岩）