鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立

尚绪增，张雅为，王兆鹏，鞠环宇，马 波，王君伟

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立

尚绪增，张雅为，王兆鹏，鞠环宇，马 波，王君伟*

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030）

为建立检测鹅细小病毒(GPV）的间接ELISA方法，本研究表达了GPV重组NS2蛋白，并以Ni-NTA亲和层析柱纯化的蛋白作为检测抗原，建立间接ELISA检测方法，并进行抗体消长规律的检测。用该方法检测阴性血清样本30份，确定检测临界值为0.281。与琼脂扩散试验结果的阳性符合率为100%，阴性符合率为86.67%。与抗鹅H5、H7、H9亚型禽流感病毒阳性血清和抗鹅副粘病毒阳性血清无交叉反应。在此基础上组装检测试剂盒，试剂盒批内变异系数为4.2%，批间变异系数为8.3%，包被抗原的酶标板在4℃可保存6个月。该方法对人工感染GPV血清检测结果表明，接种病毒后第8周，NS2蛋白的抗体水平达到峰值。本研究为GPV流行病学调查提供了一种快速、方便、敏感的抗体检测方法。

小鹅瘟；NS2蛋白；间接ELISA

鹅细小病毒病又称小鹅瘟(Gosling plague，GP），是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV）引起的能够感染各品种雏鹅、雏番鸭的急性或亚急性败血性传染病。该病多发生于4日龄～20日龄的雏鹅，发病率和死亡率高达90%～100%，但随着雏鹅日龄的增长，发病率和死亡率呈下降趋势。目前，该病仍为养鹅业主要的传染病之一，给养鹅业造成严重的经济损失[1]。GPV NS蛋白也称为Rep蛋白，主要参与病毒DNA的复制和基因表达的调节。NS2蛋白可能与病毒DNA的复制、蛋白质合成以及病毒增殖有关[4]。该蛋白具有抗原性，可以诱导机体产生抗体[5]。检测GPV的传统方法有血清学试验、琼脂扩散试验、免疫荧光试验、免疫过氧化酶染技术、ELISA、PCR和核酸探针等[2-3]。其中，ELISA方法具有快速、敏感和易于操作等优点。为早期检测GPV感染病鹅并进行隔离和治疗，需要一种能够大规模检测并且具有良好的敏感性、特异性和稳定性的检测方法。因此，本研究以重组NS2蛋白作为检测抗原，建立了检测GPV的间接ELISA方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株、质粒和血清样本 GPV H1株鸭胚弱化病毒、重组质粒pET-GPV-NS2、表达载体pET-30a、感受态细胞 Rosetta、抗鹅 H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV）阳性血清和抗鹅副粘病毒(GPMV）阳性血清，琼脂扩散试验检测为GPV阴性和阳性鹅血清均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 HRP标记兔抗鹅二抗由本实验室制备并保存；Tween-20购自宝泰克生物科技公司；四甲基联苯胺(TMB）和过氧化氢尿素购自Sigma公司；Ni-NTA Agarose购自Invitrogen公司。

1.3 包被抗原的制备 将阳性重组质粒pET-GPVNS2转化至感受态细胞Rosetta中，阳性菌接种于含卡那抗性的液体LB培养基中，37℃培养过夜，按1∶100接种于新鲜液体LB培养基，培养至对数生长期(OD600nm=0.4～0.6），加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导4 h。离心收集菌体，参照Ni-NTA亲和层析说明书进行纯化，应用紫外分光光度法检测蛋白浓度，-4℃保存备用。

1.4 间接ELISA方法的建立

1.4.1 抗原包被浓度和一抗稀释倍数的选择用PBS将纯化的NS2蛋白稀释至以下浓度：0.14 μg/孔、0.28 μg/孔、0.56 μg/孔和 1.12 μg/孔，标准阳性和阴性血清分别进行 1∶50、1∶80、1∶100、1∶160、1∶200稀释，矩阵法进行ELISA检测，选择NS2蛋白的最佳包被浓度和一抗血清的最佳稀释倍数。

1.4.2 抗原包被液和包被时间的选择包被液分别为PBS(pH7.4，0.01 mol/L）、碳酸盐缓冲液(pH9.6，0.05 mol/L）、氢氧化钠(pH12，0.25 mol/L）和含0.2 mol/L叠氮钠的PBS(pH8.6，0.05 mol/L），分别于37℃包被1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和于4℃包被过夜进行ELISA检测。

1.4.3 封闭液和封闭时间的选择分别用1%鱼源明胶、1%的聚乙烯戊醇(PVA）、0.5%鱼源明胶+0.5%PVA、1%鱼源明胶+0.5%PVA、2%鱼源明胶+0.5%PVA、1%猪源明胶+0.5%PVA、1%牛源明胶+0.5%PVA和5%脱脂乳，37℃分别封闭1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，进行ELISA检测。

1.4.4 二抗作用时间的选择常规ELISA检测，其中HRP标记的兔抗鹅二抗在37℃分别作用0.5 h、1 h和1.5 h，确定二抗最佳作用时间。

1.4.5 显色时间的选择37℃TMB分别显色5 min、10 min、15 min、20 min、25 min和30 min，确定最佳显色时间。

1.4.6 判定标准的确定应用优化的间接ELISA方法，对30份琼脂扩散试验检测为GPV阴性的鹅血清样本进行检测。根据公式：临界值=平均OD450nm值+3×标准偏差，确定临界值。

1.5 特异性试验 应用建立的间接ELISA方法检测30份琼脂扩散试验为GPV阴性的血清，抗鹅H5、H7、H9亚型AIV阳性血清，抗GPMV阳性血清。同时设置阴性和阳性对照，用以检验本方法的特异性。

1.6 敏感性试验 应用建立的间接ELISA方法检测30份琼脂扩散试验检测为抗GPV阳性的血清样本以及分别做26～213倍比稀释的抗GPV阳性和阴性血清，测定本方法的敏感性。

1.7 重复性试验 应用优化的间接ELISA方法检测阳性血清，弱阳性血清和阴性血清各1份，每份血清作4孔重复，计算批内变异系数(CV%）。在相同条件下不同时间检测阳性血清、弱阳性血清和阴性血清各1份，计算批间变异系数(CV=SD/X×100%，SD为标准差，X为算术平均值）。

1.8 保存期试验 将抗原包被的酶标反应板、血清稀释液、标准阴、阳性血清、酶标二抗和H2O2等组装成试剂盒，于4℃保存1、2、3、4和6个月，分别进行ELISA检测，比较其OD450nm值，确定试剂盒的保存期和稳定性。

1.9 GPV接种后鹅抗体消长规律的检测 用GPV弱毒人工感染3月龄鹅20只，并设置对照组鹅10只，分组饲养。接种病毒前采血，接种病毒后每周采血至14周。将该15份血清分别进行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400 和1∶12 800稀释，应用本研究建立的ELISA方法进行效价测定，同时设阴性和阳性对照。取OD450nm值大于临界值的最高稀释度为该血清的效价。进行数据分析、比较，观察抗体消长规律。

2 结果

2.1 重组NS2蛋白的制备 阳性重组质粒经IPTG诱导表达，采用Ni-NTA柱纯化，SDS-PAGE分析(图1）。分光光度法测定蛋白浓度为1.12 mg/mL。

图1 NS2重组蛋白SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant NS2 protein

2.2 ELISA反应条件的优化 经过优化，ELISA反应条件为：以PBS(pH7.4，0.01 mol/L）作为包被液，将抗原稀释至0.56 μg/孔，4℃包被过夜，1%鱼源明胶+0.5%PVA封闭2 h，一抗血清作1∶100稀释，HRP标记的兔抗鹅抗体作1∶3 600稀释，作用时间为1 h，TMB显色20 min，酶标仪检测OD450nm值。

2.3 临界值的测定 选用GPV阴性血清30份进行ELISA检测，结果经统计学分析，血清样本平均OD450nm值(X）为0.158，标准差(SD）为0.041。X+3SD为0.281。因此，将样本OD450nm≥0.281判为阳性，OD450nm<0.281判为阴性。

2.4 特异性试验 对30份琼脂扩散试验确定为GPV阴性的鹅血清样本进行检测，其中4份血清检测结果为阳性，其他为阴性，阴性符合率为86.67%。对抗鹅H5、H7、H9亚型AIV阳性血清、抗GPMV阳性血清分别进行ELISA试验，结果无交叉反应，表明该方法特异性良好(表1）。

2.5 敏感性试验 对30份琼脂扩散试验检测为GPV阳性的鹅血清样本进行检测，结果均判定为阳性，阳性符合率为100%。将3份阳性血清按26～213梯度稀释进行检测，结果显示：1号血清效价为212，2号和3号血清效价均为210，表明该方法灵敏度较高。

2.6 重复性试验 对3份血清进行重复性试验，每份血清做4孔重复。由表2和表3可见，批内和批间检测血清的OD450nm值CV值均小于10%，表明批内和批间重复性均良好。

表1 特异性交叉反应试验Table 1 ELISA specific test

表2 批内重复性试验(n=4）Table 2 Repetition of the sera OD450nmvalue within wells(n=4）

表3 批间重复性试验(n=4）Table 3 Repetition of the sera OD450nmvalue among wells(n=4）

2.7 保存期试验 取ELISA试剂盒进行质控检验与保存期试验，结果表明，批内试验CV值为4.2%±0.05%，批间试验CV值为8.3%±0.07%，4℃可保存6个月。

2.8 NS2蛋白抗体消长规律测定 将采集的15份血清倍比稀释，按照优化的ELISA反应条件进行检测，结果经分析表明：人工感染组NS2蛋白的抗体效价在接种病毒后第4周几何平均效价为672.72，之后缓慢下降，在接种病毒后第8周时达到峰值为981.27，自第9周抗体效价开始下降，第14周NS2蛋白抗体效价为448.98，效价波动性明显；对照组的抗体效价在第12周达到峰值。

3 讨论

琼脂扩散试验和中和试验是GPV抗体检测的常规方法，但均存在不足。前者检测抗体需要浓缩抗原和鹅的高免血清，而正常情况下，小鹅的免疫滴度低或未经免疫而具有母源抗体的小鹅血清滴度也达不到高免滴度，所以用琼脂扩散试验检测GP的血清阳性率低于正常，仅有少数因个体差异而具有高滴度血清抗体才能够被检测出阳性；后者虽然敏感性和特异性较高，但操作繁琐，难以推广应用[5]。本实验采用的间接ELISA方法敏感性比琼脂扩散试验高，而且操作简便。

NS2蛋白主要参与病毒DNA的复制并调节基因的表达。目前，对GPV非结构蛋白的研究较少，尤其是NS2蛋白的应用方面。试验证实NS2蛋白能够诱导机体产生抗体，具有良好的抗原性。因此，本研究选用该蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法，该方法敏感性高、特异性好，与鹅其他传染病阳性血清无交叉反应。在包被液的选择上，碳酸盐包被液与PBS的包被效果差异不明显，但PBS能够较好地保持蛋白的稳定性。因此，选用PBS作为包被液。

NS2蛋白抗体消长规律测定中，对照组抗体效价逐渐升高，在第12周达到峰值。其原因可能是实验条件受限，在实验期间未将免疫组与对照组的鹅群分离饲养，从而造成了对照组鹅通过排泄物感染了GPV。由免疫前的抗体效价可见，免疫前鹅已感染GPV，由此推断饲养鹅群的地区在接种前已存在GPV，从而造成理论值与实际值的差异。

病毒的结构蛋白是研制亚单位疫苗的首选蛋白质，具有重要的诊断价值[6-7]。而病毒的非结构蛋白产生于病毒的复制过程中，并在被感染的细胞内表达，使得感染动物能够产生抗非结构蛋白的抗体，而灭活疫苗或亚单位疫苗免疫的动物则无法产生该类抗体。根据这一特性，研究者已经将非结构蛋白应用于病毒性疾病的诊断和预防中。本实验通过间接ELISA检测方法测得GPV人工感染后抗NS2蛋白抗体消长规律，使监测GPV NS2蛋白抗体变化成为可能，对NS2蛋白的应用进行了初步探索，为有效防制GP奠定了基础。

[1]闵育娜，高玉鹏，侯水生，等.我国养鹅业现状及前景展望[J].中国畜牧杂志，2005，41(5）：57-59.

[2]布日额，王君伟，吴金花，等.GPV野毒株的分离及PCR检测方法的应用[J].中国预防兽医学报，2003，25(6）：469-472.

[3]赵妍，王君伟.二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究[J].中国预防兽医学报，2007，30(7）：710-712.

[4]布日额.GPV VP及NS基因克隆及原核表达产物的研究应用[D].东北农业大学博士研究生学位论文，2005.

[5]佘永建，胡世君，黄伟，等.利用琼脂免疫扩散试验检测小鹅瘟病毒抗原及抗体的研究[J].黑龙江畜牧兽医，1987，5：202-204.

[6]Wang C Y,Shieh H K,Shien J H,et al.Expression of capsid proteins and non-structural proteins of waterfowl parvoviruses inEscherichia coliand their use in serological assays[J].Avian Pathol,2005,34(5）:376-382.

[7]Vihinen R M,Wang D,Weichert W,et al.The VP 1 N-terminal sequence of canine parvovirus affects nuclear transport of capsids and efficient cell infection[J].J Virol,2002,76(4）:1884-1891.

Establishment of an indirect ELISA for detection of antibodies against NS2 protein of Gosling plague

SHANG Xu-zeng,ZHANG Ya-wei,WANG Zhao-peng,JU Huan-yu,MA Bo,WANG Jun-wei*

(College of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

In this study,an indirect ELISA method for detection of Goose parvovirus(GPV）was developed by using purified recombinant NS2 protein of the virus as coating antigen.The assay had a sensitivity of 100%for positive samples and 86.67%for negative samples.It had no cross reaction with goose positive serum of H5,H7,H9 subtypes of avian influenza virus,and goose paramyxovirus.The coefficient variation of intro-batch was 4.2%and the coefficient variation of inter-batches was 8.3%.The ELISA plate could be validity for storage at 4℃up to 6 months.This method was a rapidly and sensitive for the detection of GPV antibody and epidemiological survey.

Gosling plague;NS2 protein;indirect ELISA

S852.5

A

1008-0589(2010）08-0595-04

10.3969/j.issn.1008-0589.2010.08.04

*Correspondingauthor

2009-10-16

黑龙江省“十五”攻关课题(GB01B503-02）

尚绪增(1982-），男，山东淄博人，硕士研究生，主要从事动物疾病检测方法的研究.

*通信作者：E-mail：jwwang@neau.edu.cn

(本文编辑：张朝霞、杨朋欣）