消减免疫法制备抗H L60、H L60/ADR表面抗原差异抗体①

任思楣 俞 云佘 鸣 邵晓枫 师锐赞 彭洪薇 林 阳 张秀丽 张砚君 熊冬生

(中国医学科学院血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津300020)

·免疫学技术与方法·

消减免疫法制备抗H L60、H L60/ADR表面抗原差异抗体①

任思楣 俞 云②佘 鸣 邵晓枫 师锐赞 彭洪薇 林 阳 张秀丽 张砚君 熊冬生

(中国医学科学院血液病医院血液学研究所实验血液学国家重点实验室,天津300020)

目的:建立可特异识别HL60和HL60/ADR细胞膜表面差异蛋白的抗体库,制备单克隆抗体并研究其生物学活性。方法:通过Cp诱导的消减免疫法免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备可特异识别两种细胞差异膜蛋白的单克隆抗体;采用FACS和激光共聚焦显微镜鉴定其和两种靶细胞结合的特异性和差异性。结果:获得51株候选的差异抗体,成功筛选并纯化其中一株单抗(5F6)。5F6与可特异稳定的识别HL60/ADR细胞,结合率扣除本底为68.2%,而该抗体与HL60细胞的结合率为17%。结论:SI结合差异筛选的方法是制备差异抗体便捷可行的方法,所获得的单克隆抗体与HL60和HL60/ADR细胞膜蛋白结合有特异性和差异性,实验中所获得的单抗是寻找肿瘤耐药的新靶点和发现肿瘤耐药新机制的工具,为研究这些问题开拓了新思路。

消减免疫;肿瘤耐药;单克隆抗体;差异识别

肿瘤耐药是肿瘤治疗中的难题,也是目前国内外医学界研究的热点。目前已经发现的耐药机制主要有:P-糖蛋白,多药耐药相关蛋白,包括拓扑异构酶、二氢叶酸还原酶、醛脱氢酶等酶类以及和凋亡相关的一些蛋白等等,其中能在临床上得到证实甚至应用的却很少,因而发现新的耐药机制和耐药新靶点迫在眉睫。本实验采用消减免疫方法,获得了数株可特异识别敏感肿瘤和耐药肿瘤表面差异蛋白的单克隆抗体,为肿瘤多药耐药新靶点和新机制的发现奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和细胞系 小鼠SP2/0骨髓瘤细胞、H L60细胞系,耐阿霉素人急性白血病细胞系(H L60/ADR),耐药倍数为130倍,均由本室保存; BALB/c小鼠(4～6周龄),购自中国军事医学科学院。

1.1.2 实验试剂 RPMI1640(Hy CLIONEPIERCE)、HAT、HT、PEG 1450(Invitrogen);Cyclophosphamide (Cp)、Pristane、DAPI(Sigma);蛋白 G亲和色谱柱(Pharmacia);羊抗鼠 IgG-FITC、胎牛血清(本所科技开发公司);羊抗鼠IgG-HRP(北京中山生物工程公司);BCA试剂盒(PIERCE)。

1.1.3 实验仪器 激光共聚焦显微镜(Leica),流式细胞仪(FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞置37℃、5%CO2的培养箱中,用含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培养。以0.5μg/ml的剂量每四天加药一次维持 HL60/ ADR的耐药性,取处于对数生长期,生长状态良好的细胞用于实验。

1.2.2 动物的负向免疫诱导与抗血清效价检测取雌性BALB/c小鼠,腹腔注射HL60细胞(5×106),除对照组小鼠外20分钟后腹腔注射Cp(100 mg/kg小鼠体重),此后第24、48小时等量腹腔注射Cp两次[1,2]。上述操作隔周重复一次,于第三次诱导后检测动物血清效价:取小鼠尾血以PBS稀释成不同浓度,与 HL60细胞4℃反应1小时,后与羊抗鼠(IgG-FITC)于4℃孵育30分钟,洗净二抗。用流式细胞仪检测抗体与细胞的结合百分率及荧光强度,以小于对照组两倍的荧光强度为阴性值,血清效价为对应的稀释倍数。

1.2.3 动物免疫与细胞融合 最后一次负向免疫10天后,小鼠经腹腔注射HL60/ADR细胞(5×106),隔周免疫一次,共3次。取小鼠尾血,分别以HL60和HL60/ADR为靶细胞检测抗血清效价,方法及标准同上。选取以HL60为靶细胞抗血清效价最低且以HL60/ADR为靶细胞抗血清效价最高的小鼠做加强免疫。加强免疫以5×106HL60/ADR细胞经尾静脉注射,随后进行融合和杂交瘤培养[3,4]。

1.2.4 阳性克隆筛选及克隆化培养 实验采用活细胞间接标记法筛选:取细胞分泌的上清150μl分为两份,分别与HL60和HL60/ADR为靶细胞于96孔板中4℃孵育1小时。弃上清液,PBS洗两次。加入羊抗鼠IgG-FITC(20μl/孔)4℃反应30分钟,弃上清液,以PBS洗三次,弃上清将每孔细胞稀释至400 μl,上机检测细胞分泌的上清与HL60和HL60/ADR两种靶细胞的结合百分率。每孔细胞分泌的上清液检测两次,均符合如下标准可建株:(1)上清液与两种靶细胞结合百分率之比大于2.5倍以上的瘤株; (2)单株靶细胞结合率≥30%,两种靶细胞结合率之差≥20%的瘤株。

将符合标准的瘤株进行亚克隆培养和筛选,标准同上。筛选出可持续稳定分泌有差异的特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞扩大培养、冻存以备后续实验研究。

1.2.5 单克隆抗体的制备及纯化 腹腔注射杂交瘤细胞(2×106)于预先腹腔注射降植烷的BALB/c雌鼠,10～12天后取腹水,采用间接标记流式细胞仪测定效价。饱和硫酸铵预处理后,用蛋白G纯化系统纯化,分别用SDS-PAGE和BCA试剂盒检验其纯度以及蛋白浓度。

1.2.6 流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测单克隆抗体与靶细胞结合的差异性 采用FITC间接标记,流式细胞仪检测纯化抗体与HL60和HL60/ADR的结合百分率,方法同上。

将HL60、HL60/ADR细胞悬液涂于载玻片上,以丙酮和甲醇 (1∶1)固定,PBS洗两遍,以胎牛血清室温封闭20分钟,洗两遍,单克隆抗体4℃孵育1小时,FITC标记的羊抗鼠荧光二抗4℃孵育40分钟, DAPI室温孵育5分钟,染细胞核。PBS洗三遍,用60%甘油封片于激光共聚焦显微镜下观察。

2 结果

2.1 抗血清效价 经HL60和Cp三次负向免疫诱导后,实验组小鼠抗血清效价均低于400,对照组为12 800。实验组小鼠经HL60/ADR三次免疫后,以HL60/ADR为靶细胞的抗血清效价均高于以HL60为靶细胞的抗血清效价,3号小鼠以HL60/ADR为靶细胞的抗血清效价最高,高于12 800(表1)。取3号小鼠进行加强免疫及融合。

2.2 杂交瘤株的建立及差异筛选 按照上述方法及标准在首次筛选的87株杂交瘤中,我们发现有39株与 HL60/ADR的结合率高于 HL60,12株与HL60的结合率高于HL60/ADR(图1A,B),有差异的瘤株共51计株,总差异率为58.62%。将这些抗体进行亚克隆培养。经三次亚克隆培养、流式细胞仪交叉筛选后获得数株可持续稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。其中,克隆5F6生长最快,并且与两种靶细胞的结合百分率差异大,我们首先对其进行亚克隆培养,获得一株杂交瘤细胞(克隆号5F6-C5-A12,简称5F6)用于抗体制备及纯化。

2.3 单抗5F6的制备及纯化 将杂交瘤细胞5F6接种于BALB/c小鼠腹腔,获得腹水。饱和硫酸铵预处理,蛋白G纯化系统纯化,经BCA蛋白定量试剂盒定量,其浓度为1.6 mg/ml。SDS-PAGE电泳证明在非还原情况下抗体的分子量约为172 kD,经还原后重链的分子量约为56 kD,轻链的分子量约为29 kD(图2),纯度大于95%。

表1 不同组小鼠的抗血清效价Tab.1 Titer of antiserum in different mice are represented

图1 各株杂交瘤所分泌的抗体与 H L60,H L60/ADR两种靶细胞的结合百分率Fig.1 Binding percentage of hybridoma antibodies based FACS assays

图2 SDS-PAGE分析抗体5F6Fig.2 SDS-PAGEanalysis of monoclonal antibody 5F6

图3 流式细胞仪检测单抗5F6与H L60,H L60/ADR的细胞结合百分率Fig.3 Binding percentage of McAb 5F6 with H L60/ADRand H L60 cells by FACS

图4 激光共聚焦观察单抗5F6识别细胞膜抗原Fig.4 Immunofluorescence staining of membrane antigen

2.4 单抗5F6与HL60及HL60/ADR结合的差异性研究 纯化后的单抗5F6分别与 HL60和 HL60/ ADR两种靶细胞反应,经流式细胞仪检测,证明抗体与两种细胞的结合率及荧光强度有显著差异(图3)。激光共聚焦显微镜下单抗 5F6与 HL60和HL60/ADR的荧光强度有显著差异(图4),说明此单克隆抗体确实能够特异结合于HL60和HL60/ADR两种靶细胞,且有明显的差异。

3 讨论

据统计90%以上的肿瘤患者死亡不同程度受到耐药的影响,这个难题一直困扰着临床化疗工作。迄今已发现的肿瘤耐药的机制并不能很好的解释临床耐药的现象,其中能应用于临床治疗的更是少之又少。血液肿瘤的治疗无法依靠手术切除,因而化疗的耐药问题在血液肿瘤的治疗中显得尤为突出。如何发现血液肿瘤上耐药的新靶点和新机制是血液学工作者需要迫切解决的问题。

细胞膜蛋白在细胞间接触、表面识别、信号转导、酶活性和转运方面都扮演着重要的角色,是理想的检测和治疗靶点。但由于细胞膜蛋白固有的疏水性和复杂的结构,许多膜蛋白很难选择合适的溶解试剂,这使得直接研究膜蛋白非常困难。如何在血液肿瘤细胞膜上发现与耐药相关的新靶点,进一步研究其功能和新的耐药机制是本实验首要突破的问题。

研究表明,由Cp诱导的SI,操作性和重复性更强,其耐受原和免疫原既可以是结构相似的多肽、蛋白质,也可以是生物学功能相似的细胞、病毒等[5,6]。Cp作为一种免疫抑制剂被用于一些免疫过程性疾病和骨髓移植时的免疫抑制,他可诱导动物耐受非自身抗原,这种耐受主要是基于Cp优先清除抗原刺激性B细胞和T细胞的作用[7]。

HL60敏感株作为耐受原诱导动物免疫耐受,理论上受试动物应耐受敏感株表面抗原,用 HL60/ ADR免疫时动物只对耐药株不同于敏感株表面的抗原产生免疫应答,但在实验中我们筛选到了与敏感株结合率高于耐药株的单克隆抗体。在Raymond的研究中[8],这种经过消减免疫法制备的抗体优先结合于耐受原的情况也曾出现过。这可能是由于这些单抗所针对的抗原表位是次要抗原决定簇,因而逃逸了由Cp介导的对T细胞的抑制。而这些表位同样存在于免疫原HL60/ADR上,当再次接触到这些表位时,B细胞依然会对这些表位产生免疫应答。若这些表位是HL60和HL60/ADR之间的差异表位,针对他们的单抗在后期的筛选过程中依然会作为差异抗体被筛选出来。

实验采用SI方法结合流式细胞仪差异筛选抗体的方法,大大缩小了筛选抗体的工作量,缩短了筛选时间,所筛选到的抗体中按照我们自行设定的较高的差异标准,抗体中敏感株与耐药株结合有差异的抗体比率仍可达到58.6%。我们在这些杂交瘤中选取生长状态良好,与两种靶细胞结合百分率差异大的六株克隆进行亚克隆培养,最终获得四株可稳定分泌差异性抗体的杂交瘤细胞,并已稳定培养。本实验中,我们从四株已进行亚克隆并稳定培养的克隆中选取克隆5F6-C5-A12进行抗体的制备和纯化以及细胞结合功能的实验。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分别在数量和形态验证并鉴定了单抗5F6所识别的HL60和HL60/ADR上的抗原的差异性。本实验未对5F6进行Ig亚类的鉴别。在以后的实验中,我们将对其亚类进行鉴别,并用合适的方法进一步鉴定其抗原,研究抗原的作用机制。通过5F6的初步试验,我们相信,所筛选得到的这些抗体可作为日后检测和治疗肿瘤耐药的候选抗体,成为相关研究的有益工具,而相应的抗原则可能成为肿瘤多药耐药相关研究的新靶点。

1 Susan Ker-hwa Ou,Colin McDonald Paul H Pattersonet al.Comparisonof two techniques for t-argeting the production of monoclonal antibodies against particular antigens[J].J Immunolo-gical Methods,1991;145:111-118.

2 Heidi Major Sleister,A Gururaj Rao.Subtractive immunization:a tool for the generation of discr-iminatory antibodies to proteins of similar sequence [J].J Immunological Methods,2002;26(1-2):213-220.

3 邵晓枫,熊冬生,高瀛岱 et al.抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定[J].中国免疫学杂志,2007;23(2):142-145.

4 李洪涛,马 波,王君伟.抗鸭胸腺细胞单克隆抗体的制备及其免疫组织化学研究[J].中国免疫学杂志,2008;24(1):42-46.

5 Dorrell C,abraha SL,Lanxon-cookson KMet al.Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers[J].Stem Cell Res,2008;Sep;1(3):183-194.

6 Lefebvre DJ,Costers S,Van Doorsselaere Jet al.Antigenic differences among porcine circovirus type 2 strains,as demonstrated by the use of monoclonal antibodies[J].Gen Virol,2008;89(1):177-187.

7 Andries Zijlstra,Jacqueline E,Testaet al.Targeting the proteome/epitome,implementation of sub-tractive immunization[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003;303:733-744.

8 Raymond L,Mernaugh c,Heping Yan cet al.Production and characterization of mouse ureteric bud cell-specific rat hybridoma antibodies utilizing subtractive immunization and high-thr-oughput screening[J].J Immunological Methods,2005;306:115-127.

[收稿2009-07-18 修回2009-09-14]

(编辑 张晓舟)

Production of discrepant monoclonal antibody against HL60 and HL60/ADR by SI technique

REN Si-Mei,YU Yun,SHE Ming,SHAO Xiao-Feng,SHI Rui-Zan,PENG Hong-Wei,LIN Yang,ZHANG Xiu-Li,
ZHANG Yan-Jun,XIONGDong-Sheng.State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology,CAMS&PUMC, Tianjin300020,China

Objective:T o prepare and characterize specific and discrepant mouse hybridoma antibodies on membrane of HL60 and HL60/ADR cell lines.Methods:BALB/c mice were immunized by subtractive immunization induced Cp(Cyclophosphamide).McAbswere prepared by hybridoma technique,screened and detected by FACS and LSCM.Results:51 candidates and discrepant antibodies were found,and one of them(5F6)was purified and identified.Conclusion:Combination of SI with discrepant screening method should facilitate the preparing and identifying discrepant McAbsfor identifying antibodies that can distinguish the differences in proteins expressed in HL60 and HL60/ADR, which is a significative and potential method in the research and target therapy associated drug-resistance.

Subtractive immunization;Tumor drug resistance;McAb;Discrepant protein

R392.33 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2010)02-0160-04

①本文受国家自然科学基金(30873091、30971291)和天津市科技发展项目(05YFGZGX02800 08ZCGHHZ00900)资助

②南京中医药大学药学院,南京210029

任思楣(1981年-),女,在读博士,主要从事肿瘤药理学方面的研究,E-mail:simei-ren@163.com;

及指导教师:熊冬生(1961年-),男,教授,博士生导师主要从事肿瘤多药耐药和基因工程抗体方面的研究,E-mail:dsxiong1961@yahoo.com.cn。