B细胞趋化因子对CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响①

高志云 揣 侠 蓝佳明 刘贵霞 李 剑 张永红 王永祥

(河北医科大学病原生物学教研室,石家庄050017)

B细胞趋化因子对CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响①

高志云 揣 侠 蓝佳明 刘贵霞 李 剑 张永红 王永祥

(河北医科大学病原生物学教研室,石家庄050017)

目的:探讨B细胞趋化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)对柯萨奇病毒B3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影响。方法:将BALB/c小鼠随机分为4组,分别肌肉注射pcDNA3、pcDNA3/BLC、pcDNA3/C3d3-sVP1和含pcDNA3/BLC与pcDNA3/C3d3-sVP1的混合质粒,于免疫后不同时间检测小鼠血清的中和抗体滴度、特异性CT L杀伤活性;以LD50的CVB3病毒液感染已免疫小鼠,检测小鼠血中病毒滴度,观察存活情况以评价各种疫苗的免疫保护作用。结果:小鼠的中和抗体滴度随免疫次数增加而提高,混合组中和抗体滴度(42.17±1.43)和特异性CT L杀伤率(41.3%±3.51%)均明显高于pcDNA3/C3d3-sVP1组(P<0.05),而血中病毒滴度低于pcDNA3/C3d3-sVP1组;经致死量CVB3感染后,pcDNA3/BLC和pcDNA3/ C3d3-sVP1混合免疫的小鼠生存率达44%,生存率高于其他各组。结论:BLC可显著提高C3d3-sVP1基因诱导的特异性免疫应答,增强基因疫苗对机体的免疫保护作用。

B细胞趋化因子;补体3d;柯萨奇病毒B3;基因疫苗

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus group B,CVB)是人类病毒性心肌炎的主要病原体,以CVB3最为重要,迄今尚无有效的预防措施。本室前期将编码分泌型CVB3 VP1的基因和三拷贝C3d分子的基因拼接,构建了靶向B细胞的基因疫苗pcDNA3/ C3d3-sVP1,免疫小鼠后能诱导较高水平的中和抗体,对致死量CVB3感染有一定保护力,但其免疫保护作用仍不理想[1]。推测与本疫苗缺乏对B细胞的有效趋化,导致成熟B细胞在肌肉组织中分布甚少有关。

[Abstract]淋巴细胞趋化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)是人B淋巴细胞的特异性趋化因子,并对部分T细胞也有趋化作用[2]。本研究将BLC真核表达质粒作为基因佐剂,比较pcDNA3/C3d3-sVP1单独免疫和BLC质粒协同免疫诱导产生的免疫应答,为研制新型CVB3基因疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与毒株 真核表达质粒pcDNA3/BLC由Nancy HR博士和John RP教授惠赠;真核表达质粒pcDNA3/C3d3-sVP1为河北医科大学病原生物学教研室前期实验中构建[1]。采用碱裂解法大量制备质粒DNA,并用PEG法对之进行纯化[3]。CVB3 Nancy株由本室保存。

1.2 免疫接种 纯系BALB/c小鼠购自河北医科大学实验动物中心,4～6周龄,雄性,随机分为4组,分别为pcDNA3组、pcDNA3/BLC组、pcDNA3/C3d3-sVP1组、pcDNA3/B组21只,各组高渗蔗糖溶液合组pcDNA3/外,其余各组间隔4周免疫14天眼眶静的中和抗体滴

LC与pcDNA3/C3d3-sVP1混合组,每于小鼠右侧大腿股四头肌处注射25% 100μl,30分钟后原位注射质粒,除混BLC与pcDNA3/C3d3-sVP1各50μg/只剂量为100μg/只,注射前将质粒混匀, 1次,共免疫3次。每次于接种后第脉取血,采用微量中和试验法检测血清度。

1.3 特异性CT L检测 第三次免疫后2周,每组取3只小鼠处死,无菌取脾。将脾淋巴细胞用 IL-2、ConA和灭活的CVB3体外刺激3天,作为效应细胞。用经灭活的CVB3体外刺激1天的SP2/0细胞作为靶细胞。以效靶比为40∶1进行实验,靶细胞以含10%新生牛血清的1640培养液稀释至1×105ml-1,加入96孔板中,每孔100μl,每孔加入效应细胞100 μl,同时加入 IL-2、ConA和灭活的CVB3刺激,于37℃,5%CO2孵箱中培养24小时,采用CCK-8(cell counting kit-8,购自日本同仁化学研究所)法检测脾细胞杀伤活性,具体操作按说明书进行。同时设效应细胞孔和靶细胞孔各3复孔。杀伤率(%)=[1-(效靶A值-效应细胞A值)/靶细胞A值]×100%。

1.4 病毒的增殖和效价滴定 按常规在Hela细胞上培养CVB3,将病毒10倍递次(10-1～10-10)稀释; 18～20周龄BALB/c小鼠56只,按每组8只分成7组,分别注射10-4～10-107个稀释度的病毒,每只0.2 ml;逐日观察记录动物死亡数,根据 Reed-Muench法,计算LD50。

1.5 免疫小鼠的病毒感染 在小鼠3次免疫后第3周,每组取3只小鼠,腹腔注射含3 LD50的CVB3病毒液各0.2 ml。于注射后第7天,检测血中病毒滴度。同时,每组剩余的15只小鼠腹腔注射含4 LD50的CVB3各0.2 ml,观察小鼠存活情况至注射后第14天,用SPSS统计软件进行生存分析。

1.6 统计学处理 本实验数据采用SPSS11.0软件处理,以±s表示,中和抗体、病毒滴度和CT L杀伤率采用单因素方差分析和LSD-t检验;小鼠生存率和生存时间分别采用行×列表资料的Fisher确切概率法和Kaplan-Meier生存分析法。

2 结果

2.1 血清中和抗体水平 各组各次免疫后血清中和抗体平均滴度见表1。从表中可以看出,pcDNA3/ C3d3-sVP1组、pcDNA3/BLC与 pcDNA3/C3d3-sVP1混合组抗体滴度随免疫次数的增加而提高,经单因素方差分析表明,差别有统计学意义(P<0.01)。第3次免疫后,混合组的抗体效价最高,经 t检验,除pcDNA3组与pcDNA3/BLC组相比差别无统计学意义(P>0.05)外,其余各组两两比较均有统计学意义(P<0.01)。混合组血清中和抗体平均滴度高于pcDNA3/C3d3-sVP1组。

2.2 CVB3特异性CT L活性 效靶比为40∶1时,混合组的杀伤率为(41.3%±3.51%)高于pcDNA3组17.0%±2.00%)、pcDNA3/BLC组(20.0%±1.29%)和pcDNA3/C3d3-sVP1组(36.3%±2.52%)。混合组杀伤率高于其它各组,差异均有统计学意义(P< 0.01),见图1。

2.3 血中病毒CVB3滴度测定 pcDNA3/BLC+ pcDNA3/C3d3-sVP1混合组小鼠血中病毒滴度为(2.16±0.12)低于pcDNA3组 (4.83±0.21)、pcDNA3/BLC组 (4.43±0.23)和pcDNA3/C3d3-sVP1组(2.50±0.31)。混合组和其它各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 中和抗体平均滴度(±s)Tab.1 Mean neutralizing antibody titers(±s)

表1 中和抗体平均滴度(±s)Tab.1 Mean neutralizing antibody titers(±s)

Note:After the third immunization:1)Compared with pcDNA3/C3d3-sVP1 (P<0.01).

Groups After the first immunization After the second immunization After the third immunization pcDNA3 <1∶5 <1∶5 <1∶5 pcDNA3/BLC <1∶5 <1∶5 <1∶5 pcDNA3/C3d3-sVP1 7.94±1.41 19.95±1.52 31.62±1.41 pcDNA3/BLC+ pcDNA3/C3d3-sVP1 8.41±1.37 23.71±1.54 42.17±1.431)

2.4 小鼠注射CVB3后的生存情况 小鼠在接种CVB3第3天起开始发病,表现为行动迟缓、精神萎靡、毛发打绺,进食量下降,第4天开始死亡。各组在21天后的生存率分别为:混合组44%,pcDNA3/ sVP1-C3d3组33%,pcDNA3组和pcDNA3/BLC组无生存。用 Kaplan-Meier法进行生存分析,生存率曲线如图2所示,pcDNA3/BLC+pcDNA3/C3d3-sVP1混合组生存率高于pcDNA3组和pcDNA3/BLC组(P<0.05),但与pcDNA3/C3d3-sVP1组的差异无统计学意义。

图1 不同组小鼠的CTL应答Fig.1 The CTL response of BALB/c mice in different groups

图2 4 LD50攻击后小鼠生存曲线Fig.2 Survival curve of BALB/c mice challenged with 4 LD50CVB3

3 讨论

有研究显示,三拷贝C3d分子与抗原偶联后可增强抗原的免疫原性。这主要是由于C3d与B细胞上的受体CR2结合可为抗原与B细胞受体的交联提供共刺激信号,降低B细胞的活化阈值,促进抗体的亲和力成熟,调节B细胞与T细胞之间的相互作用,从而提高了疫苗的免疫原性。我们前期实验将编码分泌型CVB3 VP1的基因和三拷贝C3d分子的基因拼接,构建了靶向B细胞的基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1,免疫小鼠后获得了较高水平的中和抗体和特异性CT L杀伤活性,但免疫保护作用仍未能达到满意的效果,推测其原因之一可能是C3d3虽然能将分泌到细胞外的VP1抗原靶向提呈,被具有C3d受体的抗原提呈细胞-B细胞捕获,但由于成熟B细胞在肌肉组织中分布较少,即缺乏对B细胞的有效趋化而导致免疫效果不理想。

[Abstract]LC是唯一有选择性吸引B淋巴细胞作用的趋化因子,属于CXC类亚家族,首先在1998年发现,主要来源于脾、胸腺、淋巴结、阑尾等器官,其受体CXCR5分布在所有的外周成熟B细胞和少量的T细胞亚型上,通过BLC与受体结合可特异性趋化B细胞,并能促进其分化成熟[2,4]。有研究显示[5],经BLC修饰的弱免疫原性的抗原其免疫原性明显增强,故通过局部过表达BLC,促进B细胞的游走和激活,而后C3d偶联抗原可以与表达在B细胞和滤泡树突状细胞的CR2非特异性结合,被CR2+细胞内吞,促进了通过MHCⅡ类途径的抗原提呈。而且,BLC能够趋化特异抗原记忆性B细胞进入次级淋巴器官,迅速产生抗体[6]。本研究表明,混合组小鼠中和抗体滴度明显高于其他组;用致死量病毒感染后,血中病毒滴度显著降低,保护率高于其他各组;还可提高特异性细胞免疫水平。

综上所述,BLC与核酸疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1的联合免疫可显著提高疫苗的免疫效果,提示BLC作为一种新型的基因佐剂在抗CVB3感染免疫中具有良好的应用前景,为进一步研制高效的CVB3 DNA疫苗提供了基础。

1 赵 娜,韩小艳,王晓凌 et al.C3d对分泌型柯萨奇病毒B组3型VP1DNA疫苗的免疫增强作用[J].中华医学杂志,2007;87(36): 2561-2563.

2 Gunn M D,Ngo V N,Ansel KMet al.A B-cell-homing chemokine made in lymphoidfollicles activates Burkitt’s lymphoma receptor-1[J].Nature, 1998;391(6669):799-803.

3 萨母布鲁克J,拉塞尔D W著.黄培堂 et al译.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,1998:26-96.

4 Sehaerli P,Willimann K,Alois Bet al.CXC chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell Helper function[J]. J Exp Med,2000;192(11):1553-1562.

5 Guo J H,Fan M W,SunJ Het al.Fusionof antigen to chemokine CCL20 or CXCL13 strategy to enhance DNA vaccine potency[J].Int Immunopharmacol,2009;9(7-8):925-930.

6 Blink EJ,Light A,Kallies Aet al.Early appearance of germinal centerderived memory B cells and plasma cells in blood after primary immunization[J].J Exp Med,2005;201(4):545-554.

[收稿2009-06-03 修回2009-09-29]

(编辑 倪 鹏)

The influence of B-lymphocyte chemoattractant on the immune response of CVB3 fusion gene vaccine pcDNA3/C3d3-sVP1

G AO Zhi-Yun,CHUAI Xia,LAN Jia-Ming,LIU Gui-Xia,LI Jian,ZHANG Yong-Hong,WANG Yong-Xiang.Department of Pathogenic Biology,Hebei Medical University,Shijiazhuang050017,China

Objective:T o investigate the influence of B-lymphocyte chemoattractant on the immune response of CVB3 fusion gene vaccine pcDNA3/C3d3-sVP1.Methods:BALB/c mice were divided into 4 groups randomly,and injected intramuscularlywith pcDNA3,pcDNA3/ BLC,pcDNA3/C3d3-sVP1 and the combination with the plasmid pcDNA3/BLC and pcDNA3/C3d3-sVP1.At a certain time,they were measured for the titersfor neutralizing antibodies,specific CT L cytotoxic activity.The protective efficacyof DNA vaccinations was evaluated by titers of blood viruses and survival rate.Results:The titers for antibodies increased with the time of inoculation.More specifically,the antibody titers (42.17±1.43)and the specific CT L cytotoxic activity(41.3%±3.51%)of the mice in the combination group were remarkably stronger than in the mice with pcDNA3/C3d3-sVP1(P<0.05),but the virus titers of blood was lower.After lethal CVB3 challenge,the protection of mice from death in the combination group with the plasmid pcDNA3/BLC and pcDNA3/C3d3-sVP1 was 44%.Survival curves indicated that the survive state of combination group was better than others.Conclusion:BLC can strongly enhance the specific immunity induced by C3d3-sVP1.

B-lymphocyte chemoattractant;Complement 3d;Coxsackieviruses B3;Gene vaccine

R373.2 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2010)02-0117-03

①本文为河北省科学技术研究与发展计划项目(No.08276101D-93)

高志云(1978年-),女,硕士,讲师,主要从事病毒学研究,E-mail:gxfc-9879@163.com;

及指导教师:王永祥(1949年-),男,教授,硕士生导师,主要从事病毒学研究,E-mail:wangyongxiang1@ yahoo.com.cn。