聚维酮碘栓微生物限度检查法验证试验

丘展锋 黄国玉

建立聚维酮碘栓微生物限度检查方法，并对该法的有效性进行评价。通过试验确定了聚维酮碘栓的微生物限度检查方法。

1 材料与方法

1.1 培养基及试剂 营养肉汤培养基;改良马丁液体培养基;改良马丁琼脂培养基;玫瑰红钠琼脂培养基;营养琼脂培养基;无菌硫代硫酸钠滴定液(0.1 mol/L);0.9%无菌氯化钠溶液;pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液;胆盐乳糖培养基;甘露醇高盐琼脂平板，十六烷三甲基溴化铵平板。阳性对照菌:大肠埃希［cMcc(B)44102］，金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］，枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］，铜绿假单孢菌［ECMCC(B)10104］，白色念珠菌［CMCC(F)98001］，黑曲霉菌［CMCC(F)98003］(菌种均由中国药品生物制品检定所提供)。

1.2 供试品聚维酮碘栓，广东庆发药业有限公司生产。

2 阳性对照菌液的制备

取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌的营养琼脂斜面培养物接种于营养肉汤培养基中，35℃ 下培养18 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1 ml中含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌液备用;另取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物接种于改良马丁液体培养基中，25℃ 下培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1 ml中含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌备用;取黑曲霉斜面培养物，至改良马丁琼脂斜面培养基中培养5～7 d，加3～5 ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用0.9%氯化钠溶液稀释至每1 ml含菌数约为50～100 cfu的阳性对照菌备用。

3 预试验

常规检查法检查供试品对各种菌株的抑菌程度取供试品10 g用45℃ pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，振摇溶解，作为1:10的供试液，取该供试液各lml，分别注入平皿，再分别加入“2.”项下对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表1。

检验结果表明聚维酮碘栓对细菌、霉菌及酵母菌都具有较强的抑菌作用，故不能用常规的微生物限度检查法检查聚维酮碘栓的微生物限度。用薄膜过滤法需要用大量的冲洗液，最后我们选用了中和法进行验证。

4 验证

4.1 方法与结果

4.1.1 供试液制备方法 取供试品10 g，加至45℃含30 ml无菌水的三角烧杯中，充分振摇，使供试品溶解。然后加10 ml无菌硫代硫酸钠滴定液(0.1 mol/L)，再用45℃的pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，振摇5～10 min，作为1:10的供试液。

表1 常规检查法检查供试品对各种菌株的抑菌程度试验结果(株，%)

4.1.2 检查方法验证

4.1.2.1 细菌、霉菌及酵母菌菌数测定方法的验证(阳性菌回收率试验)菌数测定所用培养基，培养温度，培养时间:加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及相应空白组倾注营养琼脂培养基，30℃ ～35℃培养48 h;加入白色念珠菌、黑曲霉及相应空白组倾注玫瑰红钠琼脂培养基20℃ ～25℃培养72 h。

①阳性对照菌液组:取“2”项下的对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml，分别注入平皿，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表2;②稀释液对照组:取45℃含30 ml无菌水的三角烧杯，然后加入10 ml无菌硫代硫酸钠滴定液(0.1 mol/L)，再用45℃的pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释至100 ml，振摇5～10 min，作为1:10的供试液。取该供试液各lml分别注入平皿再分别加入“2”项下的对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各lml，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表2;③供试品对照组:取“4.1.1”制备的供试液各lml，分别注入平皿，倾注培养基培养后，计数。结果(见表2);④供试品试验组:取“4.1.1”制备的供试液各lml，分别注入平皿，再分别加入“2”项下对照菌液大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml，倾注相应培养基培养后，计数。结果见表2。

以上各组每次试验用2个平皿，试验重复3次。

表2 各菌种试验结果

4.1.2.2 控制菌检查方法的验证

①金黄色葡萄球菌检查方法的验证:控制菌测定所用培养基，培养温度，培养时间:加金黄色葡萄球菌至100 ml营养肉汤培养基中培养，置35℃培养24 h后，划线于甘露醇高盐琼脂平板，置35℃培养24 h。

阳性对照组 取“2.”项下对照菌液金黄色葡萄球菌1 ml，加入含有100 ml营养肉汤的培养基中培养，划线培养，观察。结果见表3。

阳性试验组取“4.1.1.”制备的供试液10 ml，接种于含有100 ml营养肉汤的培养基中，再加入“2.”项下对照菌液金黄色葡萄球菌培养，划线培养，观察。结果见表3。

供试品对照组 取“4.1.1.”制备的供试液10 ml，接种于含有100 ml营养肉汤的培养基中培养，观察。结果见表3。

②铜绿假单孢菌检查方法的验证:控制菌测定所用培养基，培养温度，培养时间:加铜绿假单胞菌至100 ml胆盐乳糖培养基中培养，置35℃培养24 h后，划线于十六烷三甲基溴化铵平板，置35℃培养24 h。

阳性对照组取“2.”项下对照菌液铜绿假单胞菌1 ml，加入含有100 ml胆盐乳糖的培养基中培养，划线培养，结果见表3。

阳性试验组取“4.1.1.”制备的供试液10 ml，接种于含有100 ml胆盐乳糖的培养基中，再加入“2.”项下对照菌液铜绿假单胞菌培养，划线培养，观察。结果见表3。

供试品对照组取“4.1.1.”制备的供试液10 ml，接种于含有100 ml胆盐乳糖的培养基中培养，观察。结果见表3。

以上各组试验每次平行测定2次，试验重复3次。

表3 控制菌检查方法验证结果

5 讨论

《中国药典》(2005年版)规定微生物限度检查法结果判定在3次独立的平行试验中，稀释液对照组及试验组细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证的回收率应不低于70%，低于70%则表明该样品有抑菌作用。控制菌检查方法验证时，阳性对照菌应检出，阴性对照菌不得检出。如验证结果达不到规定，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并对方法重新进行验证。

从以上结果可以看出，该试验方法达到《中国药典》(2005年版)的规定要求。